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SOST基因(sclerostin,SOST)位于人类基因组的17q12-21,主要在骨细胞中表达,含有两个外显子和一个内含子,编码硬化蛋白。硬化蛋白是一种糖蛋白,是骨形成的一个负调节者,SOST基因敲除的小鼠骨密度显著增加。SOST基因突变引起以骨密度增加为特征的硬缩症Van Buchem和巩膜固化(Sclerosteosis),Dutch VanBuchem则是SOST基因下游35kb处一个52kb的缺失引起的。
我们先前发现SOST基因-9247的顺式调节多态性T/C(rs1230399)与骨密度显著关联。计算分析表明rs1230399位于两个协同转录因子FOXA1和C/EBPα的中心识别区域。T/C多态影响FOXA1和C/EBPα与SOST基因DNA序列的结合,这个生物信息学的分析结果需要用实验的方法加以证明。
研究DNA与蛋白质互作的方法主要有凝胶电泳迁移率实验(Electrophoreticmobility shift assay,EMSA)、染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,CHIP)实验和反转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)等实验方法。本研究的目的就是通过EMSA、CHIP实验证明SNP位点rs1230399 T/C多态对SOST基因表达和转录因子FOXA1结合的影响。本研究结果将对全面理解rs1230399T/C多态的功能和SOST基因的表达调控有重要意义,也为揭示骨质疏松症的发病机理提供一定的理论依据。
人骨肉瘤SAOS-2细胞是研究SOST基因表达的一个比较好的细胞系,本研究以SAOS-2细胞为材料,先以Western Blot方法确定该细胞中有FOXA1蛋白的表达,再分别通过细胞外实验EMSA和细胞内实验CHIP两个方法来研究rs1230399 T/C多态对SOST基因表达和转录因子FOXA1结合的影响。
通过多次实验,EMSA结果显示我们所设计的含有T/C的探针所结合的蛋白不是我们预期的FOXA1蛋白,T/C与转录因子的结合都没有明显差异,在进一步用CHIP实验重复时也没有得到与转录因子结合的DNA序列片段。
通过RT-PCR方法研究SOST基因的本底表达,经过多次引物设计摸索中扩增出了SOST基因,实验结果表明SOST基因在SAOS-2细胞中表达量偏低。用10μM和1μM雌激素处理24h后,SOST基因和FOXA1基因转录水平的表达量都显著下降,这与绝经后妇女雌激素水平降低容易导致骨质疏松症相吻合。这个结果表明FOXA1基因可能也是雌激素调控的目标基因。SOST基因表达量的下降是否由于FOXA1转录因子下降引起还有待进一步的深入研究。