[目 的]1、建立与评价BALB/c小鼠变应性鼻炎(AR)模型,为进一步研究提供实验对象。2、制备人脐带间充质干细胞(hUCMSC),包括分离、扩增培养、传代、冻存以及其滴剂的制作,为实验研究及临床治疗提供材料。3、利用小鼠AR模型评价多种途径移植hUCMSC治疗AR的疗效,示踪绿色荧光蛋白(GFP)标记hUCMSC在体内的分布并阐明hUCMSC的治疗机制,为hUCMSC应用于临床治疗提供技术方法和理论依据。[方法]1、小鼠AR模型的建立和评价:选用15只健康的4～6周龄的BALB/c雌性小鼠,随机分为A、B、N组,每组5只,均于SPF环境下正常饲养。A、B组采用浓度分别为 25μg OVA/2 mgAl(OH)3、50 μgOVA/2 mgAl(OH)3 的致敏剂200μl腹腔注射三次(每周一次),之后连续7天用20 μl OVA激发液滴鼻(左右鼻孔各10 μl);N组采用200μl生理盐水代替OVA,腹腔注射、滴鼻的频次与A、B组相同。从滴鼻操作开始后每天观察小鼠打喷嚏、流鼻涕等情况,计算其评分;小鼠鼻粘膜取材行HE染色,观察其组织结构变化;ELISA法检测各组小鼠血清IL-4及IFN-γ浓度;BCA法测定各组小鼠血清总蛋白含量;PCR法测定各组小鼠脾脏组织IL-4、6、10及IFN-γ mRNA的转录水平。对建立的小鼠模型进行鉴定及评价,明确最佳AR模型创建方法。2、hUCMSC体外培养、鉴定及GFP标记:取健康足月的新生儿脐带,将其剪开为1 mm3大小的组织块贴壁法分离、培养,经过2到3次传代扩增,使用倒置相差显微镜观察hUCMSC的生长特性,流式细胞术分析hUCMSC中CD73、CD90、CD105、CD34及CD45抗原阳性表达比例,定向诱导hUCMSC分化为类脂肪、成骨样和成软骨样细胞,分析其分化潜能。采用GFP体外标记hUCMSC,通过荧光显微镜及流式细胞术分析GFP的标记率。3、hUCMSC的治疗:按前期实验明确的最佳AR模型创建方法建立4～6周龄的BALB/c雌性小鼠模型30只,随机分为模型治疗A、B组和模型对照M组,每组10只。A、B组小鼠采用200 μ1浓度为2.0×105 cells/ml的hUCMSC悬液分别腹腔、尾静脉注射治疗小鼠,3天一次,共6次;M组不做治疗。增加一组健康对照N组,数量为10只,不做任何处理。四组小鼠均饲养于SPF环境下,在末次注射治疗的第2天,处死小鼠取材。4、hUCMSC的疗效与机制评价:①治疗开始后每天观察小鼠打喷嚏、流鼻涕等情况,计算其评分;小鼠鼻粘膜行组织切片HE染色,观察其组织结构变化;ELISA法检测各组小鼠血清中的IL-4、IFN-y浓度;BCA法测定各组小鼠血清的总蛋白含量;PCR法测定各组小鼠脾脏组织IL-4、6、10及IFN-y的mRNA转录水平,评价hUCMSC治疗小鼠AR模型的疗效。②对三组小鼠分别通过滴鼻、腹腔注射、尾静脉注射GFP标记hUCMSC,取材后通过组织切片荧光单标及流式细胞术分析hUCMSC在小鼠体内的迁移和定植,观察细胞进入鼻腔组织的情况。5、各实验所得的数据用均数±标准差表示各实验组间差异的显著性,采用SPSS统计软件采用重复测量和方差分析,进行两两比较,以;p<0.05作为差异有显著性的指标。[结果]1、模型建立与评价结果:与N组比较,A、B组小鼠症状评分明显增加(P<0.05),其中A组更为明显;A、B组鼻粘膜HE染色的结果显示局部炎症细胞浸润较N组明显;A组血清IFN-y、IL-4、总蛋白含量明显升高(p<0.05),B组血清IFN-γ含量也升高(p<0.05),但B组血清IL-4及总蛋白含量仅稍有增加(p>0.05);A组脾脏组织IL-4、6及B组IL-6 mRNA的转录水平明显升高(p<0.05),其他因子的mRNA转录水平稍升高(p>0.05)。2、hUCMSC的培养、鉴定及GFP标记:采用组织块剪碎直接贴壁法培养hUCMSC大约1周后可见细胞从组织块爬出,经过反复组织贴壁培养后细胞呈成纤维样且具典型的涡旋式生长特征;第四代hUCMSC表面抗原表达结果,CD73、CD90和CD 105的阳性表达比例分别为100.0%、99.1%和99.2%,而CD34和CD45的阳性表达比例分别为0.05%和0.30%;诱导成骨分化3周,茜素红染色呈阳性;诱导成脂分化2周,油红O染色呈阳性;诱导成软骨4周,阿新蓝染色呈阳性。体外采用GFP成功标记hUCMSC,荧光显微镜下细胞显示出明显绿色荧光,流式细胞术分析GFP的标记阳性率达到100%。3、hUCMSC的疗效与机制评价:①与M组比较,小鼠AR模型从治疗开始至结束,A、B组症状评分逐步降低,从第4天开始明显下降(p<0.05),第15天接近于5分;A、B组纤毛结构较完整,炎症细胞浸润减少;A组血清总蛋白含量稍下降(p>0.05),B组下降更为明显(p<0.05);A、B组血清IFN-y和IL-4浓度均有所下降(p<0.05);A组脾脏组织IL-10和IFN-y mRNA转录水平明显下降(p<0.05),A 组 IL-4 mRNA 转录水平稍下降(p>0.05),B 组 IL-4、10 和 IFN-y mRNA转录水平明显下降(p<0.05),但A、B组IL-6 mRNA转录水平有所上升,且A组更为明显(p<0.05)。②小鼠体内示踪标记的hUCMSC,免疫荧光单标观察组织切片,发现心脏、肺脏、卵巢及鼻粘膜处均可见荧光细胞,且各组小鼠鼻粘膜处的荧光细胞于第2周最多;流式细胞术分析进一步证实各组小鼠鼻腔粘膜荧光细胞均在第2周时数量最多。[结 论]1、采用OVA腹腔注射加鼻部激发诱导法建成小鼠AR模型,且该模型效果好,可重复性高。2、采用多次组织块反复直接贴壁培养法获得形态、生长特性、细胞表面表达标志物和诱导分化潜能均符合标准的hUCMSC。GFP标记hUCMSC效果好,细胞稳定,可用于动物体内示踪。3、腹腔及尾静脉注射两种方式移植hUCMSC治疗小鼠AR模型均具有一定的疗效,且尾静脉注射疗效更好。hUCMSC动物体内示踪,显示三组小鼠均在第2周鼻部hUCMSC最多。