研究目的肺癌是在全国乃至全世界范围内致死率最高的恶性肿瘤。近年来,以表皮生长因子受体（EGFR）突变为靶点的靶向治疗药物,对特定基因亚型的非小细胞肺癌（NSCLC）患者的疗效十分明显,它不仅治疗效果好,而且毒副反应轻。但大部分接受第一代酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗的患者在中位数10-12个月后,会产生耐药性。研究表明,该耐药机制可分为原发性耐药和获得性耐药。原发性耐药主要是指首次采用TKI治疗,但未获益或获益不明显者。获得性耐药主要是指肿瘤具有已知的与TKI敏感相关的EGFR突变,并且先前接受过连续单药EGFR-TKI治疗,但疾病仍进展。获得性耐药的原因主要有:EGFR基因的二次突变（如T790M突变）,某些基因的通路失调（如c-MET扩增）等,但仍有约40%的获得性耐药机制不明。基于以上研究背景,我们在临床工作中收集了69例对第一代酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药的IIIb-IV期的非小细胞肺癌（NSCLC）患者的肿瘤组织样本和血液样本,其中有21例进行了二次活检和二次血液取样。对这21例患者的标本进行检测,我们在排除T790M突变、c-MET基因的扩增、病理类型转化等原因后,发现了一些关键的突变基因,筛选出SOX3基因突变可能与肺腺癌对一代EGFR-TKI的耐药相关。所以,本课题旨在研究SOX3基因突变在肺腺癌EGFR-TKI获得性耐药中的作用,并探讨其可能的机制。研究方法1)通过慢病毒感染在PC9（含有EGFR 19DEL突变）、HCC827细胞（含有EGFR19DEL突变）中过表达SOX3基因及其突变体SOX3Mut,建立稳转细胞系。通过RT-q PCR（实时荧光定量PCR）、Western Blot（蛋白免疫印迹）实验,鉴定SOX3和SOX3Mut在细胞中过表达。2)通过MTT、平板克隆实验,对上述稳转细胞系进行细胞功能实验研究,评判SOX3基因突变是否影响细胞对EGFR-TKI的敏感性。3)通过Western Blot检测稳转细胞系中cleaved Caspase-3、cleaved PARP等与细胞凋亡相关的蛋白的表达,通过流式细胞术对稳转细胞系进行凋亡分析,观察并分析SOX3基因突变是否影响EGFR-TKI诱导的细胞凋亡。4)通过裸鼠皮下荷瘤体内实验,分析SOX3基因突变与EGFR-TKI耐药是否相关:构建裸鼠皮下移植瘤模型,给予EGFR-TKI治疗后,分析表达SOX3和SOX3Mut的肿瘤生长情况;通过对肿瘤组织进行HE染色及免疫组化染色,分析病理类型及Ki-67蛋白及cleaved caspase-3蛋白的表达状况。5)通过转录组测序和Western Blot分析SOX3基因突变可能影响的细胞信号通路,探索EGFR-TKI耐药相关的分子机制。研究结果1)在PC9、HCC827细胞中建立了稳定转染空载体对照、SOX3和SOX3Mut的细胞系。MTT实验分析表明与对照组相比,过表达SOX3Mut,增加了PC9和HCC827细胞对EGFR-TKI的抵抗,克隆形成实验显示过表达SOX3Mut的PC9和HCC827细胞在EGFR-TKI药物暴露下的克隆形成能力明显增强。2)与对照细胞相比,表达SOX3Mut的细胞在EGFR-TKI处理后,细胞cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白水平减少,Annexin V/PI流式细胞分析也证实,与对照细胞相比,EGFR-TKI诱导表达SOX3Mut的细胞凋亡能力下降。3)建立了裸鼠的皮下移植瘤模型,经EGFR-TKI治疗后,过表达SOX3Mut的实验组肿瘤的重量明显大于过表达SOX3和表达空载体的对照组;肿瘤生长曲线也显示,停用TKI治疗4周后,过表达SOX3Mut实验组的肿瘤生长比其他两组快。对肿瘤组织进行免疫组化分析发现,与过表达空载体、SOX3相比,过表达SOX3Mut的肿瘤组织中Ki67的表达上升,而cleaved caspase-3表达下降,说明过表达SOX3Mut的肿瘤组织中的细胞增殖能力升高,且细胞凋亡比例降低。这些体内实验结果与体外细胞实验的结果一致,都表明SOX3Mut导致肺腺癌细胞对EGFR-TKI抵抗。4)机制研究发现SOX3Mut导致肺腺癌细胞对EGFR-TKI耐药的机制可能是通过增加Erk蛋白的磷酸化,激活了MAPK信号通路。经转录组测序及生信分析显示Erk蛋白磷酸化可能进一步激活了JMJD7-PLA2G4B融合蛋白,促进肿瘤细胞的增殖和抑制肿瘤细胞的凋亡。结论经过相关的体外、体内实验的验证,我们推测SOX3基因突变是导致EGFR-TKI获得性耐药的新机制。SOX3基因突变可能是通过增强Erk蛋白的磷酸化,抑制了EGFR-TKI诱导的细胞凋亡,从而导致了一部分有敏感突变的NSCLC患者对EGFR-TKI的获得性耐药。