干细胞生物学的研究一直是生命科学领域的热点问题。精原干细胞(SSCs)作为其中一部分，近年来已成为干细胞生物学的重点研究模型。转壁氏生物反应器提供的模拟微重力环境给在地球上研究空间细胞生物学提供了可能和方便。迄今，已经成功研究了一些不同类型的细胞甚至器官在模拟微重力条件下的生物学特性，然而SSCs作为精子发生的最原始细胞，SSCs在模拟微重力条件下的生长特性的研究尚未见报道。因此本研究旨在揭示模拟微重力条件下小鼠SSCs的生长特性。本论文以出生后5—7d的雄性昆明小鼠为主要研究对象，建立了小鼠SSCs的分离、纯化、优化培养和鉴定体系，建立了模拟微重力下SSCs的培养体系，进而以静态平面培养为对照，研究了两个不同培养体系对SSCs的生长、增殖的影响；并探讨了SSCs的体外诱导和分化感染。主要研究结果如下： ⑴采用两步酶消化法成功获得睾丸组织单细胞悬液，印证了三次差异贴壁法是一种简便有效的SSCs纯化方法，通过细胞涂片鉴定其纯化效率可达到平均85.06％；以DMEM为基础培养基，添加5％FCS，经MC处理的MSC饲养层细胞为培养条件，采用MTT法结合细胞形态学观察检测SSCs的增殖情况。结果发现，以20ng/ml rmbFGF、20ng/ml rrGDNF和103U/ml mLIF组三种因子的组合浓度添加是昆明小鼠SSCs的体外培养的最佳组合，SSCs能在体外维持增殖培养58d，体外传代6次；采用免疫细胞化学方法和AP活性检测SSCs的标志抗原，检测抗原包括Ngn3、OCT4、β1—integrin和AP活性，结果表明培养的细胞特异表达这些SSCs标志抗原；采用RT-PCR方法检测SSCs的三个标志基因：Ngn3、OCT4和GFRα1，结果表明在mRNA水平上，培养的细胞特异扩增出目的片断。故得出上述培养体系支持了SSCs的体外增殖，培养的细胞仍能维持SSCs的特性。 ⑵模拟微重力条件下，将纯化的原代SSCs与经MC处理的MSC饲养层细胞按照2：1的比例接种，总接种细胞密度约为5×105个/ml(下同)，以血纤维蛋白膜为支架，RWVB最初的旋转速度14～16rpm，同时静态平面培养为对照，进行了为期14d的体外培养。观察细胞与支架的依附情况，在体外培养3d、6d和14d抽样测量细胞聚集体的大小和提取总RNA，旋转培养结束时，对细胞聚集体进行鉴定。结果表明三维旋转培养下血纤维蛋白膜支持了SSCs的增殖，培养14d时，细胞聚集体的直径达到平均242.627±16.529μm，这些细胞聚集体是由SSCs和饲养层细胞组成。OCT4、GFRα1和Bcl6b三个SSCs标志基因在旋转培养的三个阶段都有表达，并且mRNA表达水平随培养时间的延长而逐渐升高，但6d，与静态平面对照相比，此三个基因的mRNA表达水平较低。 ⑶在培养液中去掉生长因子，培养条件同3，三维旋转培养和静态平面培养3d，采用流式细胞术、AP活性染色和台盼兰染色方法检测，结果表明三维旋转培养3d后Ngn3+百分率、AP+百分率和细胞活率较静态平面培养降低了。结果提示着模拟微重力条件下培养小鼠SSCs可能也需要生长因子的添加，另外也有可能是三维旋转培养的最初的生长滞后期所致，需要进一步验证。 ⑷模拟微重力条件下，将纯化后的富含SSCs(检测其纯化率约为51.35％)的细胞悬液接种培养，以FACTⅢ微载体为支架，最初的旋转速度10～12rpm，同时以静态平面培养为对照培养进行10d的体外培养。分别在培养的3d、7d和10d用AP活性染色计算SSCs的数量，并在旋转培养10d后再平面继续培养检测SSCs的克隆形成能力。结果发现与静态平面对照培养相比，三维旋转培养最初3d对SSCs的生长不利，但随着培养的时间的延长，培养10d时，三维旋转培养AP+细胞数极显著高于平面对照(P<0.01)，并且三维旋转培养后的SSCs仍然具有克隆形成能力。 ⑸模拟微重力条件下，以FACTⅢ微载体为支架，纯化的原代SSCs直接三维旋转培养35d(无饲养层细胞的添加)，结果发现SSCs分别在培养7d—12d和17d—22d增殖，并且在17d—22d增殖迅速，SSCs数量得到了倍增，培养各个阶段AP活性染色，都有较高比例的AP+百分比，克隆形成能力检测出现典型的SSCs克隆簇。这充分说明了SSCs在模拟微重力条件下培养35d后仍维持着SSCs特性。相比之下，静态平面培养SSCs在培养的3d—7d出现一缓慢增殖，而后SSCs数量不断下降。 ⑹应用含有FSH、睾酮激素和成年小鼠睾丸组织浸提液等成分诱导液将小鼠SSCs体外诱导至圆形精子细胞阶段。通过改变成年小鼠睾丸组织浸提液的添加时间和提高睾酮激素的含量，优化了诱导培养液，使优化的诱导培养液显著提高了诱导效果。模拟微重力条件下培养35d的SSCs，经静态平面诱导培养9d和12d，出现带鞭毛的圆形精子细胞和延长后的精子细胞。用带EGFP报告基因的慢病毒转染分化阶段的精原细胞，发现诱导6d时感染，感染效率明显高于诱导2d时感染。