目的:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是常见的消化道肿瘤之一,近几年来其已逐渐发展成为发病率位居世界第三的恶性肿瘤。目前全球每年新增CRC患者人数超过一百万,且这一数量仍在逐年递增。肠炎相关结直肠癌（Colitis-associated colorectal cancer,CAC）是CRC的一种亚型,该病患者治愈困难,死亡率极高,因此给现代医学带来极大挑战。目前,关于CAC的发病机制尚不完全清楚,因此探索CAC发病机制的相关研究突显得尤为重要。CD30和CD30配体（CD30 ligand,CD30L,CD153）,分别属于肿瘤坏死因子受体超家族（Tumor necrosis factor receptor superfamily,TNFRSF）和肿瘤坏死因子超家族（Tumor necrosis factor superfamily,TNFSF）成员。本项目组以往工作中利用CD30L或CD30基因敲除小鼠,探讨了CD30L和CD30在肠黏膜免疫细胞上的表达以及对小鼠炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）肠道炎症发生和发展的影响。证明了CD30L/CD30信号在小鼠IBD肠道炎症性病变形成机制中发挥重要的促炎作用。提示CD30L/CD30信号可能在CAC“炎-癌”转变及肿瘤炎症微环境形成过程中发挥潜在作用。重要的是,以往有关CD30、CD30L与肿瘤的相关的研究多局限于淋巴系或血液来源肿瘤范畴,而关于CD30L/CD30信号转导在肠炎相关结直肠癌的发病机制中的作用研究却鲜有报道。因此,为了深入探讨CD30L/CD30信号转导如何调控肿瘤免疫微环境,进而影响CAC的发生发展,本研究利用了CD30L基因敲除小鼠建立肠炎相关结直肠癌CAC模型,探讨CD30L基因缺失后对小鼠CAC肿瘤免疫微环境的形成及肿瘤进展的影响,为今后进一步深入研究CD30L/CD30信号在实体肿瘤发生、发展中的作用机制提供可参考的理论依据。研究方法:1.利用AOM联合DSS建立C57BL/6小鼠CAC动物模型:取小鼠结直肠和肠肿瘤组织,提取总蛋白,利用Western Blot技术检测样本组织内CD30L和CD30蛋白的表达变化;提取样本组织RNA,利用Real time-PCR技术检测样本组织内CD30L和CD30基因的mRNA表达变化。2.利用WT、CD30LKO小鼠建立CAC动物模型:动态比较观测CD30L基因缺失对小鼠CAC病变形成过程中体重、生存率、肠道长度、不同级别肿瘤数量、肿瘤大小、脾脏的体积和重量的变化情况。同时用小鼠内窥镜检测了WT和CD30LKO小鼠诱导CAC前后肠道肿瘤的变化情况,以及利用HE染色技术检测小鼠肠道组织的病理学变化。3.利用Real time-PCR技术检测WT和CD30LKO小鼠肠肿瘤组织内抑癌基因、促癌基因、抑凋亡基因、促炎细胞因子、趋化因子等的mRNA表达变化,以及小鼠肠黏膜组织内细胞因子的变化情况。4.利用流式细胞技术检测WT和CD30LKO小鼠肿瘤免疫微环境中MDSCs表型变化,及其PD-L1表达情况;TAMs表型变化,及其PD-L1表达情况。利用ELISA检测肿瘤免疫微环境中细胞因子变化情况。5.利用流式细胞技术检测诱导CAC前后WT小鼠肿瘤免疫微环境中CD4⁺和CD8⁺T细胞经TCR刺激0h、16h、32h后表达CD30和CD30L的变化情况;6.利用流式细胞技术检测WT及CD30LKO小鼠肿瘤免疫微环境中CD4⁺和CD8⁺T细胞分泌的效应性细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-2等;T细胞分化相关转录因子RORγt、Tbet;表面抑制性分子PD-1;增殖标志物Ki-67表达变化情况。利用ELISA法检测效应性细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-2分泌水平。研究结果:1.与正常对照组相比,诱导CAC后肠黏膜组织内CD30L和CD30蛋白表达显著增加。CAC小鼠肠道肿瘤组织和癌旁组织内CD30L和CD30的mRNA水平也明显高于远端肠组织。即诱导CAC肠道肿瘤发生后,小鼠肠黏膜组织内CD30L和CD30的表达异常升高,提示CD30L/CD30信号转导可能在CAC病变形成中发挥潜在的重要作用。2.CD30LKO与WT小鼠相比其体重和生存率降低,肠道肿瘤数目显著增多,组织病理学分析显示CD30LKO小鼠肠黏膜组织内肌层明显增厚,腺体更不完整,炎性细胞浸润显著增加。结果证明,CD30L基因缺失导致小鼠对CAC的易感性显著增强,肿瘤负荷明显加重,暗示CD30L/CD30信号转导可能通过调控肠道肿瘤免疫微环境的形成,在CAC病变形成中发挥重要的抗肿瘤作用。3.CD30L基因缺失导致肠道肿瘤组织内mRNA水平上的抑癌基因APC、p53下调,抑凋亡基因Bcl-xl、Bcl2下调,血管内皮生长因子表达显著上调。T细胞活化与分化相关细胞因子IL-17A、Granzyme B、perforin、TNF-α、IFN-γ和IL-2 mRNA的表达均下调,同时IL-1β、IL-6和IL-10等炎症性细胞因子mRNA表达升高。趋化因子CXCL1,CXCL2上调,CCL2下调,而CCL5和CCL20表达无明显差异。在CAC肠黏膜组织中,CD30L基因缺失同样导致IL-17A、Perforin、Granzyme B、TNF-α、IFN-γ和IL-2 mRNA表达下调,而IL-10和IL-6的表达上调。结果暗示了CD30L基因缺失可导致CAC小鼠肠道肿瘤免疫微环境向有利于肿瘤发生发展的方向转化,进而促进CAC病变形成。4.WT小鼠诱导CAC后,肠黏膜固有层内MDSCs细胞比例增加,其表达的PD-L1上调,CD30L表达也上调。提示,CD30L基因缺失可能影响MDSCs分化。与WT小鼠相比,诱导CAC后,CD30LKO小鼠肠组织内MDSCs的比例明显升高,且G-MDSCs和M-MDSCs的比例和数量均增高,MDSCs表面表达的PD-L1显著增强。CD30L基因缺失虽然没有影响TAMs的比例和数量,但却显著上调了MHCII⁺TAMs和MHCII^-TAMs细胞PD-L1的表达。与WT小鼠相比,CD30LKO小鼠LPL培养上清中IL-1β,IL-6和IL-10明显升高。结果暗示,CD30L可能通过抑制肠道肿瘤免疫微环境中MDSCs的蓄积,以及MDSCs和TAMs细胞表面免疫检查点-PD-L1的表达,进而促进CD30⁺效应性T细胞所介导的抗肿瘤免疫应答。5.新鲜的CD4⁺和CD8⁺T-LPL细胞可表达低水平的CD30L和CD30,在体外培养16小时或32小时后,活化的CD4⁺和CD8⁺T细胞表面CD30L和CD30的表达逐渐增强。CAC小鼠肠黏膜固有层内的CD4⁺和CD8⁺T细胞表面CD30L和CD30的表达与正常小鼠相比显著增强。并且TCR刺激可显著上调CD4⁺和CD8⁺T细胞表面CD30L和CD30表达的强度。结果提示,CD30L和CD30通过分子间相互作用调控肠黏膜固有层CD8⁺和CD4⁺T细胞的分化与效应功能,进而在CAC肠道肿瘤发生及肿瘤免疫微环境形成中发挥重要的保护性作用。6.诱导CAC后CD30LKO小鼠肠黏膜固有层淋巴细胞（LPL）内CD4 T_EM显著降低,且LPL和肠系膜淋巴结（MLN）中CD4 T_EM表面PD-1的表达强度上调;IFN-γ⁺,TNF-α⁺,IL-17A⁺,IFN-γ⁺TNF-α⁺、TNF-α⁺IL-17A⁺、IL-2⁺CD4⁺T细胞明显降低。而且,CD30L基因缺失导致核转录因子RORγt和Tbet的表达被抑制。CD44⁺CD4⁺T细胞的IFN-γ和Ki-67的表达也降低。ELISA结果显示CD30LKO小鼠分泌的IL-17A,IFN-γ,TNF-α和IL-2水平降低。此外诱导CAC后CD30LKO小鼠LPL内CD8 T_EM降低,且LPL和MLN中CD8 T_EM表面PD-1的表达强度上调,但Ki-67的表达减弱。而且,效应性CD44⁺CD8⁺CTL细胞IFN-γ,Perforin,Granzyme B和Ki-67的表达均显著下调。结果证明CD30L基因缺失抑制小鼠肠固有层CD4⁺Th细胞和CD8⁺CTL细胞活化、分化及增殖,进而抑制肠道肿瘤免疫微环境内T细胞所介导的抗肿瘤免疫应答,最终导致小鼠对CAC易感性显著增强。结论:1.小鼠诱导CAC后CD30L和CD30呈现高表达。2.CD30L基因缺失可增加小鼠对CAC敏感性,使CD30LKO小鼠肿瘤加重。3.CD30L基因缺失使MDSCs蓄积增多,表面抑制分子PD-L1表达增强,肠道肿瘤免疫微环境向有利于肿瘤发生发展的方向转化。4.CD30L/CD30信号缺失抑制小鼠肠固有层CD4⁺和CD8⁺T细胞活化、分化及增殖,抑制肠道肿瘤免疫微环境内T细胞所介导的抗肿瘤免疫应答,促进CAC进展。