目的应用UPLC-MS/MS技术,研究龙胆泻肝汤体外化学成分和口服给药后大鼠的血中移行成分,揭示其体内直接作用物质,为龙胆泻肝汤药效物质基础研究提供备选化合物。分析龙胆泻肝汤对大鼠肝胆湿热的治疗作用,利用代谢组学的方法深入探讨龙胆泻肝汤对大鼠肝胆湿热模型代谢轮廓和生物标记物的影响,揭示其作用机制。方法基于中药血清药物化学的理论和方法,应用UPLC-Q-TOF/MS技术,分别建立龙胆泻肝汤体外化学成分和口服给药后大鼠血中移行成分的分析方法,分析及鉴定体内外的化学成分,并通过对体内外样品的色谱图进行直观分析,揭示龙胆泻肝汤的血中移行成分。以大鼠的外观表现、胆汁分泌量、生理生化指标和病理组织学评价湿热环境下以酒精混合液结合高脂高糖灌胃液建立的大鼠肝胆湿热模型,利用代谢组学方法评价龙胆泻肝汤对大鼠肝胆湿热的治疗作用和作用机制。结果1.体外化学成分分析利用UPLC-Q-TOF技术,系统建立了龙胆泻肝汤体外化学成分分析方法,应用该方法分析鉴定了 111个化学成分,以黄酮类成分居多,还有环烯醚萜类、皂苷类、生物碱类和甾醇等。其中,12个来自于龙胆,1 1个来自于栀子,5个来自于柴胡,9个来自于泽泻,25个来自于黄芩,7个来自于车前子,12个来自于当归,19个来自于甘草,5个来自于木通,3个来自于地黄,另有1个共同来自于黄芩、车前子、木通、地黄,1个共同来自于栀子和车前子,1个共同来自于柴胡、黄芩、车前子、木通。2.血中移行成分分析在体外分析方法的基础上,通过对大鼠采血时间和血清处理方法的优化,采集大鼠含药血清的色谱图,与空白血清及体外样品色谱图中各峰的保留时间、高低碰撞能质谱数据的直观比较分析,共表征了 25个龙胆泻肝汤血中移行成分,21个原型成分和4个新的代谢产物。主要包括京尼平苷、车前子苷、黄芪苷、黄芩苷、汉黄芩苷、焦地黄苷,甘草皂苷G2,这些化学成分可能成为龙胆泻肝汤的药效物质基础。3.龙胆泻肝汤治疗大鼠肝胆湿热的作用机制研究实验采用湿热环境下以酒精混合液结合高脂高糖灌胃液的方法建立肝胆湿热模型,发现模型组大鼠造模4周后肛温升高、胆汁分泌量减少,AST、ALT、ALP、T-Bil、CHOL、TG、γ-GT、TBA、MDA 含量明显增加,SOD 含量降低(P<0.05,P<0.01),肝脏组织病理切片显示有脂肪肝、脂肪变性等现象,说明大鼠肝胆湿热模型建立成功。4周造模结束,用龙胆泻肝汤治疗造模后大鼠,2周结束后,发现治疗组大鼠各项指标均显著回调。对液质联用仪分析方法进行优化,建立适用于大鼠尿液代谢组学研究的分析方法,并对其代谢轮廓和代谢轨迹进行分析,鉴定出40个生物标记物,并找出这些标记物影响的相关代谢通路。对龙胆泻肝汤治疗组、模型组和空白组数据比较,结果显示治疗组尿液代谢轮廓向正常回调,有19个生物标记物具有明显的回调趋势。这些具有显著差异的生物标记物可以作为龙胆泻肝汤治疗肝胆湿热的药效生物标记物,以此揭示其作用机制。结论本实验利用UPLC-Q-TOF技术成功表征了111个龙胆泻肝汤体外化学成分,并对龙胆泻肝汤入血成分进行了初步鉴定,共发现25个血中移行成分,为龙胆泻肝汤药效物质基础的深入研究提供依据。实验成功建立肝胆湿热模型,龙胆泻肝汤能够减轻或消除大鼠肝脏炎症,显著回调肝胆湿热的各项指标,证明龙胆泻肝汤可以有效治疗大鼠酒精性肝胆湿热。