毛竹(Phyllostachys pubescens)与铺地竹(Pleioblastus argenteastriatus)叶黄酮类化学成分及其生物活性的研究

来源 :中国林业科学研究院 | 被引量 : 17次 | 上传用户:hitlic2009
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竹叶黄酮是竹叶提取物主要功能性成分,具有优良的生物学功效,应用前景广阔。以毛竹(Phyllostachys pubescens)和铺地竹(Pleioblastus argenteastriatus)为材料,通过热回流和自然浸泡法提取,萃取法、硅胶柱、AB-8大孔树脂柱、Sephadex LH-20凝胶柱、RP-18反相硅胶柱层析法纯化分离,质谱、紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱图进行结构鉴定,对分离得到的15个化合物进行了结构鉴定:通过分光光度法和高效液相色谱法(HPLC)测定黄酮含量,对六个纯化黄酮工艺、两种黄酮含量测定方法进行了比较研究;通过AB-8大孔树脂柱层析法对竹叶提取物初步纯化分离,得到黄酮含量不同的组分,对这些组分的抗氧化活性和抑菌活性进行了研究。结果如下:(1)称取毛竹叶粉1000g,用95%乙醇热回流提取,提取液浓缩后用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取分离,各萃取相浓缩得浸膏,把乙酸乙酯和正丁醇萃取相合并后用硅胶柱层析粗分,然后用Sephadex LH-20凝胶柱、RP-18反相硅胶柱层析法分离得到5个单体化合物,根据其质谱、紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱图进行了结构鉴定,结构鉴定结果和分离得到的5个化合物重量分别如下:化合物1:苜蓿素-7-O-葡萄糖苷,18.5mg;化合物2:木犀草素-6-C-葡萄糖苷(异荭草苷),118.4mg;化合物3:洋芹素-6-C-葡萄糖苷(异牧荆苷),86.7mg;化合物4:黄酮类化合物,具体结构有待进一步鉴定,32.8mg;化合物5:苜蓿素(tricin),44.3mg。(2)称取铺地竹叶粉961g,用95%乙醇自然浸泡提取,提取液浓缩,浓缩液上AB-8大孔树脂柱,分别用纯水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、丙酮洗脱,各洗脱组分浓缩,分别得到样品:P20(纯水洗脱后,20%乙醇洗脱下组分),P40(20%乙醇洗脱后,40%乙醇洗脱下组分),P60(40%乙醇洗脱后,60%乙醇洗脱下组分),P80(60%乙醇洗脱后,80%乙醇洗脱下组分),PA(80%乙醇洗脱后,丙酮洗脱下组分)。然后用Sephadex LH-20凝胶柱、RP-18反相硅胶柱层析法分离得到10个单体化合物,根据其质谱、紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱图进行了结构鉴定,结构鉴定结果和分离得到的10个化合物重量分别如下:化合物6:苜蓿素,107.4mg;化合物7:木犀草素-7-O-葡萄糖苷,5mg;化合物8:有待进一步鉴定,1mg;化合物9:木犀草素-6-C-洋地黄毒糖基-7-O-葡萄糖苷,29.6mg;化合物10:为黄酮类化合物,具体结构有待进一步鉴定,30.8mg;化合物11:苜蓿素-7-O-葡萄糖苷,10mg;化合物12:为黄酮类化合物,具体结构有待进一步鉴定,332.5mg:化合物13:木犀草素-6-C-芸香糖苷,449.3mg;化合物14:有待进一步鉴定,66.7mg;化合物15:有待进一步鉴定,5mg。(3)称取毛竹叶粉30g,用70%乙醇超声辅助提取,提取液过滤浓缩用水定容至1000mL,每个工艺吸取100mL作分离纯化试验,对六个纯化工艺进行了比较研究,结果表明:最佳工艺为聚酰胺柱吸附法,工艺流程为:取100mL水溶液→减压浓缩得浓缩液→拌入聚酰胺并上聚酰胺柱→水洗→以70%乙醇洗脱至检不出黄酮→洗脱液→减压浓缩定容至100mL→测定黄酮含量。对测定黄酮含量的分光光度法和HPLC法进行了比较研究,结果表明:分光光度法比HPLC法测量结果略微偏高,两种方法均稳定可靠。(4)称取毛竹叶粉6000g,用95%乙醇热回流提取,提取液浓缩,浓缩液上AB-8大孔树脂柱,分别用纯水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、丙酮洗脱,各洗脱组分浓缩,分别得到样品:M20(纯水洗脱后,20%乙醇洗脱下组分);M40(20%乙醇洗脱后,40%乙醇洗脱下组分);M60(40%乙醇洗脱后,60%乙醇洗脱下组分);M80(60%乙醇洗脱后,80%乙醇洗脱下组分);MA(80%乙醇洗脱后,丙酮洗脱下组分)。样品P40,P60,P80,PA同(2)。叔丁基对苯二酚(TBHQ)和2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)为合成抗氧化剂。用清除有机自由基二苯基三硝基苯肼(DPPH)的方法评价样品抗氧化活性。通过研究DPPH溶液吸收光谱,高浓度和低浓度DPPH溶液体系中加入TBHQ、BHT、M40后的吸光值变化,DPPH溶液质量浓度与吸光值的关系等,得出以下结论:分光光度法测样品清除有机自由基DPPH的方法中,反应体系反应40min后测定结果稳定,测定波长为518.4 nm。通过测定TBHQ、BHT对DPPH自由基清除率曲线,提出以IC50值(当清除率达到50%时,抗氧化剂的浓度值)作为评价样品清除DPPH自由基能力的指标,样品IC50值分别为:TBHQ(21.14mg╱L),BHT(42.09mg╱L),M20(141.11 mg/L),M40(108.40mg╱L),M60(177.38 mg/L),M80(268.21 mg╱L),MA(837.67 mg╱L),P40(173.26 mg╱L)、P60(319.82 mg/L),P80(519.67 mg/L),PA(364.50mg╱L),清除DPPH自由基能力由强到弱依次为:TBHQ>BHT>M40>M20>M60>P60>P40>PA>P80>MA,其中以M20,M40,M60抗氧化活性较强,IC50值分别达到BHT的29.86%,38.85%,23.73%。(5)用清除超氧阴离子(O2·-)的方法评价样品M20,M40,M60,M80,MA,TBHQ抗氧化活性。通过对邻苯三酚自氧化产物的吸收光谱,邻苯三酚自氧化速率,邻苯三酚浓度,缓冲液pH值对清除率的影响的研究,得出如下结论:分光光度法测样品清除超氧阴离子能力的方法中,测定波长为319.5 nm,反应体系反应1min后测,测定9次,每分钟测一次,共测9min,自氧化速率V0=0.035,反应体系加入邻苯三酚0.3mL,缓冲液pH值为8.2。以IC50(清除率为50%时,抗氧化剂浓度)作为评价样品清除超氧阴离子的指标。样品IC50值分别为:M20(402.56 mg/L),M40(298.69mg/L),M60(352.68mg╱L),M80(320.58mg/L),MA(459.68mg/L),TBHQ(95.01mg╱L),清除超氧阴离子能力由强到弱依次为:TBHQ>M40>M80>M60>M20>MA,和TBHQ的IC50值相比,样品M20,M40,M60,M80,MA分别达到TBHQ清除能力的23.60%、31.81%、26.94%、29.64%、20.67%。(6)用清除羟自由基(·OH)的方法评价样品M20,M40,M60,M80,MA,TBHQ的抗氧化活性。通过研究Fe2+与邻二氮菲生成红色配合物的吸收光谱,样品清除羟自由基能力的研究,得出以下结论:分光光度法测样品清除羟自由基的方法中,测定波长为509.1nm。在清除率为50%时,各样品的浓度远高于TBHQ,在清除率为70%时,以TBHQ的浓度为基准,样品M20,M40,M60,M80,MA的清除能力分别相当于TBHQ的清除能力的33.54%,40.55%,39.36%,22.36%,3.35%,清除羟自由基能力由强到弱依次为:TBHQ>M40>M60>M20>M80>MA。(7)通过在猪油中加入M40,M60,P40,P60,TBHQ,BHT,把猪油放入70℃烘箱中,每隔24h测定其过氧化值(POV),结果表明:M40,TBHQ,BHT抗氧化作用明显,M40抗氧化作用基本达到了TBHQ,BHT的效果,M60、P40、P60也有一定的抗氧化作用。(8)通过测试M20、M40、M60、M80、MA对棉花红腐菌(Fusarium spp)、苹果炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz)、番茄枯萎菌(Fusarium oxysporum Schlechtendahl),P40、P60、P80、PA对棉花红腐菌的菌丝生长抑制率试验,结果表明:样品M20、M40、M60、M80、MA均具有良好的抑菌效果;48h时,对棉花红腐菌、苹果炭疽菌、番茄枯萎菌的EC50值(菌丝生长抑制率为50%时,抑菌剂的浓度)最小的样品及其EC50分别是:M20(1.10g/L),MA(0.49g/L),M80(0.704g╱L);72h时,对棉花红腐菌、苹果炭疽菌、番茄枯萎菌的EC50值最小的样品及其EC50分别是:MA(0.75g/L),MA(1.28g╱L),M80(2.3g╱L)。高浓度(10g╱L)样品P40,P60,P80,PA对棉花红腐菌具有良好的抑菌效果,其中P80为效果最好,在120h时,菌丝生长抑制率还能达到98.8%。
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