[目的]垂体腺瘤（Pituitary Adenoma,PA）是颅底神经外科常见多发病,临床上有45～55%的PA因为过度增殖而表现明显侵袭性,常侵犯海绵窦、蝶窦、颈内动脉等重要组织结构,临床处理棘手。当前很少有可靠的生物标志物可以预测垂体腺瘤的发生发展进程。本研究旨在试图探讨PA中COL6A6的表达及其调控的可能分子作用机制,有助于进一步阐明PA的发病机制,为将来建立可能的干预手段寻找到新的分子靶点。[方法]基于GEO生物数据库对垂体腺瘤GSE26966微陈列进行初步数据挖掘,进行基因差异化分析及基因集富集分析,筛选出潜在目标基因COL6A6及与其密切相关的P4HA3进行系列研究。收集2017年6月-2018年3月期间于昆明医科大学第一附属医院神经外科手术治疗的原发性垂体腺瘤患者30例临床标本及15例有效的垂体腺瘤瘤旁组织标本,利用RT-qPCR及免疫组化技术分析目标基因COL6A6在垂体腺瘤组织与瘤旁组织中的表达差异。此外,同时收集30例病例的基本资料,分析COL6A6表达与30例垂体腺瘤病例临床特征相关性,同时评估Knosp分级与手术全（近全）切除率及手术相关并发症的相关性。与此同时,在体外进行垂体腺瘤AtT-20及HP75细胞系传代培养与目标基因质粒行细胞转染,两种细胞系均分别分为3组:NC（Negative Control,NC）组;COL6A6组（使用pc-DNA-COL6A6质粒转染）及沉默组（使用si-COL6A6质粒转染）。通过Western blotting分析各组之间COL6A6表达情况;CCK-8吸附法评估各组间肿瘤细胞增殖能力;Transwell入侵试验检测肿瘤细胞侵袭能力;划痕愈合试验评估肿瘤细胞迁移能力;流式细胞仪检测细胞凋亡;同时Western blot检测Ncadherin、Ecadherin及Vimentin蛋白表达情况评估各组上皮间充质转化能力。另外,我们同时建立了 AtT-20及HP75细胞系异位垂体腺瘤裸鼠皮下成瘤动物模型,并分为NC组及COL6A6组。动态测量肿瘤生长大小,于模型建立肿瘤体内生长4周后处死小鼠,比较各组肿瘤体积及重量变化;Western blot分析两组之间COL6A6表达差异,以及Ncadherin、Ecadherin及Vientin蛋白表达情况;免疫组化检测组织中Ki67表达差异。在此基础上,我们进一步评估了 COL6A6与P4HA3对PI3K/Akt信号通路的分子作用机制。采用体外细胞培养,空白质粒及PCDNA-COL6A6质粒转染HP75及AtT细胞系后分为4组:NC组（空白质粒转染组）,COL6A6组（pcDNA-COL6A6 转染组）,COL6A6+P4HA3 组,COL6A6+IGF-1 组。Western blotting 检测各组样本 COL6A6、P4HA3、及 PI3K、p-PI3K（p85）、Akt、p-Akt（ser473）蛋白表达量,评估PI3K/Akt信号通路与COL6A6、P4HA3之间的关系;同时采用CCK-8吸附法、Transwell入侵实验、划痕愈合实验进一步评估各组肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移能力;最后再次采用Western blotting检测各组Ncadherin、Ecadherin及Vimentin蛋白表达情况评估各组上皮间充质转化能力。另外,我们同时建立了 AtT-20及HP75细胞系异位垂体腺瘤裸鼠皮下成瘤动物模型,分为NC 组、COL6A6 组（使用 pc-DNA-COL6A6 质粒转染）以及 COL6A6+IGF-1 组。动态测量肿瘤生长大小,于模型建立肿瘤在体内生长4周后处死小鼠,比较各组肿瘤体积及重量变化。[结果]基于垂体腺瘤GSE26966微陈列进行差异基因初步分析结果:所有样本中共表达基因20307个,垂体腺瘤与正常垂体之间共有1403个差异表达基因,其中上调588个,下调815个;COL6A6在正常垂体与垂体腺瘤中表达差异明显;GSEA基因富集分析PI3K/Akt、ECM受体相互作用等信号通路被显著激活。PA中与PI3K/Akt信号通路相关的P4HA3表达上调;COL6A6与P4HA3蛋白作用网络关系密切。临床垂体腺瘤标本RT-qPCR分析结果显示:与垂体腺瘤瘤旁组织相比,PA组织中(COL6A6表达下调（1.40±0.98,2.73±1.06,P<0.001）,P4HA3表达上调（4.41±1.34,2.02±0.75,P<0.001）。COL6A6 的表达与 PA 肿瘤大小（P=0.035）及Knosp分级（P=0.013）成负相关,但与年龄（P=0.464）、性别（P=0.491）及肿瘤亚型（P=0.984）无明显相关。30例PA中,Knosp分级3～4级合计全（近全）切除率明显低于1～2级患者合计全（近全）切除率（9/19;10/11,P=0.020）;30例PA中,Knosp分级与手术相关并发症并未显示相关。垂体腺瘤AtT-20及HP75细胞株体外实验COL6A6功能验证结果:垂体腺瘤AtT-20及HP75细胞中COL6A6呈明显低表达。与NC组相比,pc-COL6A6（即过表达COL6A6）组/si-COL6A6（即沉默表达COL6A6）组AtT-20及HP75细胞中COL6A6蛋白表达水平分别显著升高/降低,差异有统计学意义（P均<0.001）;pc-COL6A6组/si-COL6A6组分别抑制/增强细胞增殖能力,差异具有统计学意义（P均<0.05）;且显著抑制/增强细胞侵袭及迁移能力,差异有统计学意义（P均<0.01）。与NC组比较,pc-COL6A6组/si-COL6A6组分别显著下调/上调AtT-20及HP75细胞N-cadherin和Vimentin的表达,差异具有统计学意义（P均<0.01）,且同时分别上调/下调了 E-cadherin的表达,差异有统计学意义（P均<0.01）;与NC组比较,pc-COL6A6组/si-COL6A6组较分别促进/降低细胞凋亡能力,差异有统计学意义（P均<0.05）。另外,在异位垂体腺瘤裸鼠模型体内实验中,与NC组比较,pc-COL6A6组COL6A6蛋白表达量时显著上调,差异有统计学意义（P<0.01）;明显抑制了 AtT-20及HP75肿瘤的大小、体积（P<0.01）以及肿瘤重量（P<0.001）的增长;同时,pc-COL6A6组分别显著下调肿瘤组织N-cadherin和Vimentin的表达,差异有统计学意义（P均<0.01）,且上调了 E-cadherin的表达,差异有统计学意义（P<0.01）;免疫组化结果显示pc-COL6A6组肿瘤组织中Ki-67表达降低。在COL6A6与PI3K/Akt信号转导通路评估中,体外细胞实验结果如下:与NC组比较,过表达COL6A6组显著降低P4HA3蛋白的表达（P<0.01）,同时降低了 p-PI3K（p85）和Akt活性位点之一ser473的表达,两组之间p-PI3K/PI3K与 p-Akt/Akt 比值差异有统计学意义（P<0.01）;COL6A6+P4HA3 组 p-PI3K（p85）和p-Akt（Ser473）的表达逆转上调,p-PI3K/PI3K及p-Akt/Akt比值与过表达COL6A6组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;COL6A6+IGF-1组p-PI3K及p-Akt同样显著逆转升高,p-PI3K/PI3K及p-Akt/Akt比值与COL6A6组比较,差异具有统计学意义（P<0.01）。此外CO-IP实验发现COL6A6与P4HA3蛋白存在免疫共沉淀现象。COL6A6+P4HA3组及COL6A6+IGF-1组均较COL6A6组显著促进了 AtT-20及HP75细胞的增殖（P<0.01）、侵袭（P<0.01）及迁移（P<0.01）能力,但这2组与NC组之间差异无统计意义;COL6A6+P4HA3组及COL6A6+IGF-1组均较过表达COL6A6组显著上调AtT-20及HP75细胞N-cadherin和Vimentin的表达,差异具有统计学意义（P均<0.01）,而同时下调了E-cadherin的表达,差异具有统计学意义（P均<0.01）,但这2组与NC组之间差异无统计意义。在异位垂体腺瘤裸鼠模型体内实验中,与过表达COL6A6组比较,COL6A6+IGF-1组明显增加了肿瘤的大小、体积（P<0.01）及肿瘤重量（P<0.001）,但COL6A6+IGF-1组与NC组比较差异无统计学意义。[结论]（1）COL6A6在垂体腺瘤组织中低表达;P4HA3在垂体腺瘤组织中高表达。（2）COL6A6与垂体腺瘤Knosp分级负相关,垂体腺瘤Knosp分级与手术全（近全）切除率负相关。（3）上调COL6A6可负调控体外及体内垂体腺瘤AtT-20及HP75细胞的增殖、侵袭及迁移能力。（4）上调COL6A6能负调控垂体腺瘤AtT-20及HP75细胞中P4HA3的表达,并进一步负调控Ser473的表达,阻断PI3K/Akt通路,从而抑制了体外及体内垂体腺瘤AtT-20及HP75细胞增殖能力。（5）过表达P4HA3能逆转COL6A6对垂体腺瘤AtT-20及HP75细胞抑制作用。（6）COL6A6与P4HA3关系密切,两者间存在蛋白相互作用。（7）COL6A6可能在PA中发挥“抑癌基因”作用,可为将来建立可能的PA预测及干预手段提供一种新的潜在分子靶点。