基于mRNA和microRNA联合分析探讨PHB提高异育银鲫免疫力的机制

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异育银鲫(Carassius auratus gibelio)是我国的主要淡水养殖鱼类之一,病害是阻碍银鲫养殖业可持续发展的第一要素。前期研究已证实聚-β-羟基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)作为一种新型益生元,具有提高异育银鲫免疫力和增强抗病力功效,但其具体作用机制尚不明确。本论文采用高通量测序对比分析日粮添加PHB(4%,30 d)后异育银鲫脾脏mRNA和miRNA的相对表达,并在细胞水平解析羟基丁酸(β-HB)对异育银鲫脾脏白细胞抗氧化酶活性和JAK/STAT及Th1/Th2细胞分化通路中关键基因表达的影响。结果表明:(1)与对照组相比,饲投PHB组共筛选出7005个显著差异表达的mRNAs和41个差异表达miRNAs。其中,3095个mRNAs表达显著上调,3910个mRNAs表达显著下调;显著差异表达的miRNAs共有41个,包括22个known miRNAs和19个novel miRNAs。其中,22个known miRNAs中10个miRNAs显著上调,12个miRNAs显著下调;同时在19个novel miRNAs中有8个显著上调,11个显著下调。(2)差异表达的22个known miRNAs主要靶向241个免疫相关基因,包括STAT1、JAK1、NF-κB1等,且这些miRNAs参与如B细胞受体信号通路、Th1/Th2细胞分化、JAK/STAT信号通路等20个免疫相关通路。GO富集和KEGG通路分析结果显示,这些靶基因主要富集于B细胞受体信号通路、Th17细胞分化、Th1和Th2细胞分化、JAK/STAT信号通路、趋化因子信号通路等。(3)miRNA-mRNA联合分析多数差异表达miRNAs对靶基因mRNAs的表达呈负调控,且每个差异表达miRNA的靶基因数量从1个到多个不等。差异表达miRNAs及其靶基因RT-q PCR验证表达结果与高通量测序获得的结果一致。(4)基于PHB不溶于水、以及在动物肠道内自然降解为羟基丁酸(β-HB)的特性,本部分以脾脏原代培养白细胞为模型探讨β-HB的免疫增强机制。结果表明,β-HB能够降低细胞内NO浓度和细胞毒性,提高白细胞抗氧化酶活性和降低MDA含量,减少白细胞的氧化损伤,对细胞具有较好的氧化损伤保护作用;进一步,通过酶活测定和RT-q PCR分析代表性差异表达miR-1971-x在PHB调控白细胞抗氧化活性中的功能;结果显示,miR-1971-x参与PHB对免疫细胞抗氧化性能的调控作用,且miR-1971-x负调控JAK/STAT和Th1/Th2细胞分化通路中关键基因的表达。
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