昆虫对环境的适应能力在其生存繁衍过程中占据着重要地位。昆虫属于变温动物,对环境温度的变化相比恒温动物更为敏感,周围温湿度的变化会对其行为、代谢、生长及发育等多方面产生重大影响。因此,解析昆虫抗高温高湿机制对有效地控制有害昆虫和加强对经济昆虫的利用具有重大意义。家蚕（Bombyx mori）是具有重要经济价值的昆虫,同时也是国际公认的农林害虫主要类群鳞翅目的研究模式昆虫,是极好的研究对象。家蚕作为遗传学传统实验动物之一,有着丰富的遗传资源,尤其是其对不同环境条件存在着抗性差异的家蚕品系,为研究其抗性机制提供了珍贵材料。本研究通过对家蚕不同抗性品系之间的对比,筛选出两个高温高湿耐受性差异极显著的品种,通过对两个品种在高温高湿冲击后转录组和甲基化组进行联合分析,鉴定家蚕抗高温高湿的关键基因,并对鉴定到的候选基因进行功能及作用机制研究。获得的主要研究结果如下:1.家蚕抗高温高湿材料的鉴定与遗传分析通过对比分析四川省农业科学院蚕业研究所保存的400份家蚕种质资源材料10年饲养成绩和茧丝质成绩后发现,不同家蚕品种在五龄经过、全龄经过、四龄结茧率、虫蛹生命率、死笼率、全茧量、茧层量、茧层率、万蚕产茧量和万蚕产丝量等健康性和产质量指标方面均存在差异,抗逆性强的品种和抗逆性弱的品种之间存在极显著差异。在遗传背景相同的情况下,由于定向选择和饲养方式的改变,也会造成品种抗逆性的改变,经济指标也会呈现显著性的差异。结果表明,造成品系间和系统间健康性指标差异除了跟外部环境、桑叶质量和饲养技术水平等方面相关外,还跟品种自身的抗病力、环境适应力和免疫应答机制密切相关。通过遗传分析和高温高湿条件冲击实验,我们发现家蚕二化性品系7532和二化性品系龙角（Knobbed）对高温高湿分别表现出抗性和敏感,且差异极显著,是鉴定家蚕抗高温高湿相关基因及解析其机制的良好材料。通过7532和Knobbed对高温高湿耐受性的调查分析,7532实验组和对照组均表现出较强抗高温高湿能力,对照组5区250头蚕7日死亡数为4头,死亡率1.60%;实验组5区250头蚕7日死亡数为3头,死亡率1.20%。Knobbed实验组和对照组差异明显,对照组5区250头蚕7日死亡数为100头,死亡率40.00%;实验组5区250头蚕死亡数250头,并在第2日就出现大量死亡,第5日全部死亡,死亡率100.00%。综上,7532表现出较强的抗高温高湿能力,Knobbed对高温高湿的饲养环境极为敏感,我们将它们作为后续鉴定家蚕抗高温高湿基因的实验材料进行研究。2.转录组学分析家蚕抗高温高湿基因为系统分析家蚕7532和Knobbed品系在抗高温高湿方面的差异,探究家蚕对高温高湿环境的免疫应答机制以及筛选家蚕抗高温高湿的关键基因,我们利用RNA-seq技术对7532和Knobbed在常规饲养条件下和高温高湿冲击条件下的实验样本进行了转录组测序分析。我们选取并收集了在不同时间点（1、6、24和48 h）7532和Knobbed实验组与对照组家蚕幼虫的m RNA,构建了16个转录组数据库,每个样品Phred数值大于30碱基占总碱基的百分比（Q30）至少为87.04%。经过数据过滤,16个样品的Clean Reads在6.00-7.82 Gb之间,与参考基因组的覆盖率在61.34%-74.32%之间,表明获得的数据均可用于后续分析。通过数据处理和分析,我们鉴定了出4944个差异表达基因,其中包含4390个注释基因和554个新基因。为了探究差异表达基因的表达模式,基于所有样本的log10（FPKM+1）值对差异基因进行聚类分析发现,高抗品系7532和敏感品系Knobbed非常有规律的聚合在一起,差异表达基因在不同实验材料和不同处理方式下呈现规律分布;7532在处理48h时,基因表达差异最为明显,敏感品系Knobbed在处理6h时,基因表达差异最为明显,表明48h可能是家蚕对高温高湿做出应激反应的关键时间点。为了更好地分析耐湿热相关基因,我们对经过处理48h的7532和Knobbed样本差异表达基因进行了GO分类和KEGG通路富集分析,共鉴定出747个差异基因,GO分类分析显示富集在3个功能组,生物过程、细胞组成和分子功能,包括代谢过程、蛋白水解、氨基聚糖代谢过程、胞外区、丝氨酸肽酶活性、丝氨酸水解酶活性、丝氨酸内肽酶活性、作用于L-氨基酸的肽酶活性、肽酶活性、催化活性、内肽酶活性和水解酶活性。KEGG通路富集分析也证实了GO分类结果,差异表达基因在代谢途径显著富集。通过构建多种模式的韦恩图进行基因筛选对比分析发现,BGIBMGA005701和BGIBMGA010163基因在两个品系处理的4个时间点均差异表达,有6个基因在处理6h、24h和48h后均存在表达差异,分别为BGIBMGA000387、BGIBMGA004579、BGIBMGA004675、BGIBMGA004910、BGIBMGA011699和BGIBMGA013893;在对照组中,BGIBMGA003739、BGIBMGA005876、BGIBMGA011821和Novel01749在4个时间点均存在表达差异,这些基因也将是后续研究的重点。此外,我们选择了11个差异表达基因进行q RT-PCR分析,结果显示基因的表达趋势与RNA-seq数据一致,证明了转录组比较分析的可靠性。3.基于全基因组甲基化鉴定家蚕抗高温高湿基因为了探究DNA甲基化在家蚕高温高湿胁迫反应中的作用,我们采用全基因组亚硫酸盐测序对耐湿热性显著不同的两个家蚕品系的DNA甲基化水平进行了全面的比较分析。以7532和Knobbed品系在24h和48h两个时间点（分别设对照和处理组）的8个样本为材料构建基因组DNA文库,从8个文库中分别获得了15.85-21.31Gb的原始碱基。在进行质量控制和数据过滤后,在所有样品中获得15.11-20.21Gb的有效碱基,其中41.07%-49.13%的有效数据与家蚕参考基因组唯一匹配,重复率为13.14%-17.22%;此外,亚硫酸盐转化率均高于99.7%,表明WGBS的完整性和准确性。为了进一步分析组别间全基因组DNA甲基化模式,我们计算了CG、CHG和CHH背景下的胞嘧啶甲基化水平。在抗性品系中,约0.14%的基因组C位点甲基化,而在敏感品系中,约0.12%的C位点甲基化。同时,在CG背景下,抗性品系组和敏感品系组的平均胞嘧啶甲基化水平分别为0.66%和0.54%,而在CHG和CHH背景下,所有组的胞嘧啶甲基化水平几乎可以忽略不计。通过样本间甲基化水平的相关性分析研究发现,相同品系样本之间的相关性非常高（R2>0.95）,而不同品系之间的相关性则相对较低,介于0.80到0.83之间。同时,在相关性分析的基础上,我们进一步进行了聚类分析,结果表明相同品系的样本聚在一起,然而处理后抗性品系的样本聚在一起,而敏感品系的样本则没有聚在一起,表明高温高湿对抗性品系的DNA甲基化有更大的影响。对高温高湿处理48h后抗性和敏感两个品系（RT＿48h和ST＿48h）和对照组两个品系（RNT＿48h和SNT＿48h）基于CG位点的不同基因组功能区DNA甲基化水平分析结果显示,在两个样本中不同功能区的DNA甲基化水平不同,外显子区的DNA甲基化水平最高,其次是内含子区,启动子和重复区甲基化水平相对较低,DNA甲基化在转录起始位点（TSS）附近的基因体区域达到高峰。在抗性品系处理48h（RT＿48h）和敏感品系处理48h（ST＿48h）两组样品中（CG背景）,共鉴定了2934个不同的甲基化区域（DMRs）,分别对应于1230个DMR相关基因（DMGs）。GO和KEGG分析表明这些DMGs在结合、细胞代谢过程和RNA转运通路中富集最为显著。为了进一步研究甲基化区域对应的差异表达基因和转录组数据中获得的差异表达基因之间的关系,我们对两种基因数据进行了关联分析。结果表明,在处理组中,有4个基因（BGIBMGA007132、BGIBMGA008110、BGIBMGA012515和BGIBMGA014048）因高甲基化而下调,3个基因（BGIBMGA008664、BGIBMGA010840和BGIBMGA012129）因低甲基化而上调;在未处理组中有3个基因（BGIBMGA007132、BGIBMGA001151和BGIBMGA014048）因高甲基化而下调,3个基因（BGIBMGA001644、BGIBMGA008664和BGIBMGA009130）因低甲基化而上调。其中3个基因（BGIBMGA007132、BGIBMGA014048和BGIBMGA008664）在两种对比分析方式中均被鉴定了出来。此外,我们还通过q RT-PCR和焦磷酸测序分别对转录组和甲基化位点进行了验证,结果显示均与组学数据一致,证明了我们数据的可靠性。以上结果表明,DNA甲基化在家蚕对环境胁迫的反应中起着重要作用,同时也为鉴定高温高湿胁迫下家蚕关键抗性基因提供了重要线索。4.家蚕S-腺苷蛋氨酸合成酶基因（BmSAMS）调控高温高湿机制解析为了分析通过转录组学和甲基化组学筛选的候选基因在抗性品系和敏感品系高温处理后的表达特征,通过q RT-PCR分析了候选基因在不同品系中表达特征。结果显示,候选基因BmSAMS基因在家蚕抗高温高湿品系中普遍高量表达,在低抗品系中表达量相对较低。为了分析BmSAMS基因的蛋白水平的潜在功能特征,通过生物信息学分析了该基因结构、表达和定位特征,确定该基因在昆虫中高度保守,具有典型的S-Ado Met结构域,BmSAMS基因在家蚕后部丝腺表皮、中肠、马氏管和脂肪体等抗性相关组织高量表达,在家蚕细胞质、细胞核、线粒体和高尔基体等细胞器中均高量表达。过表达BmSAMS基因,在27℃和35℃处理后,细胞增殖活力都明显上升,可以提高细胞增殖活力以抵抗细胞在极端温度条件下的劣势,使细胞能够稳定存活。通过免疫共沉淀筛选了BmSAMS可能的相互作用蛋白,结果显示BmSAMS与核糖体蛋白S3（Ribosomal Protein S3,RPS3）、异质核核糖核蛋白K（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hn RNPK）、r RNA加工蛋白Ebp2（r RNA processing protein Ebp2）、骨形态发生蛋白-2（bmp-2 protein isoform X1,BMP-2）、核糖体蛋白S3a（Ribosomal Protein S3,RPS3a）和肌动蛋白（Actin）具有潜在的相互作用。我们进一步对BmSAMS基因与它们之间的调控关系进行探究,结果显示,过表达BmSAMS基因后能够显著促进Bm PPE、Bm Actin和Bm RPS3基因表达;对Bm HNRK、Bm RPS3a和Bm BMP2基因具有明显的抑制作用。