GAs作为一类重要的植物激素,在植物发育和生理过程中起着重要的调控作用。GA20氧化酶直接催化生成具有生物活性的GAs,是赤霉素生物合成途径中的关键调节酶,是植物矮化的关键基因。日本结缕草在国内南方应用非常广泛,但绿期短、对某些生物及非生物胁迫抵御能力差。本研究通过分析日本结缕草GA20氧化酶基因的表达模式以探讨该基因对非生物胁迫的响应,构建日本结缕草GA20氧化酶基因的RNA干扰植物表达载体,改进农杆菌介导转化法,将其干扰载体转入日本结缕草中,以期获得具有矮化表型且抗性得到提高的日本结缕草转基因植株。首先,选取日本结缕草(Zoysia japonica Steud.)成熟种子为材料,采用研磨、浸泡处理和随机接种方式,对日本结缕草进行愈伤组织诱导,并利用诱导出的胚性愈伤组织进行再生成植株,短时间内获得大量高质量的原始胚性愈伤组织材料,为后期改进农杆菌介导法转化日本结缕草的研究提供大量的胚性愈伤组织材料,奠定了良好的基础。其次,在参照水稻、小麦、玉米及高羊茅、多年生黑麦草等草坪草相关研究基础上,进一步针对农杆菌介导日本结缕草遗传转化体系影响转化效率的三大重要影响因子,摸索出最佳菌液浓度(OD600值为0.5-0.6),侵染时间(15min)及共培养时间(2-3d)。结合转化过程中所用培养基的改良,最终转化效率达到50%以上。同时,通过改进农杆菌清洗方法,使在筛选培养的过程中排除了农杆菌的污染,与以往的农杆菌介导转化方法相比,大大减少了工作量,节约了成本,避免了愈伤材料的浪费。最终建立了一套新的农杆菌介导法转化日本结缕草胚性愈伤组织的改良体系。再次,在前期日本结缕草再生体系建立和农杆菌介导日本结缕草遗传转化改良体系建立的基础上,选用日本结缕草GA20氧化酶基因同源性相对较高的283bp片段,采用RNA干扰(RNAi)技术构建日本结缕草的干扰载体pC1301-ZjGA20ox-RNAi。将ZjGA20ox的RNA干扰载体转入日本结缕草,经过抗性愈伤组织筛选,分化与再生,进行抗性植株分子检测。通过抗性植株表型观测发现部分转基因植株呈现半矮化现象。RT-PCR检测结果表明,呈现矮化的日本结缕草植株体内ZjGA20ox基因未见明显表达,证明ZjGA20ox-RNA干扰基因已整合到日本结缕草植物基因组中。最后,针对日本结缕草未转基因植株,通过RT-PCR技术研究ZjGA20ox基因在日本结缕草不同生长发育阶段和不同组织部位的表达模式,以及对照植株在不同调控因素(低温(4℃)、氧化(H202)、盐(NaC1)、干旱(PEG6000)和高温(42℃))调控下的表达模式。结果表明,ZjGA20ox基因在根部都没有表达,叶部的表达有明显可见的扩散条带。随着生长发育(生长15天、5个月、10个月)阶段的不同,ZjGA20ox基因在叶部的表达呈现下调的趋势。在日本结缕草的不同组织器官中,ZjGA20ox基因在嫩叶和叶鞘中均有明显可见的扩散条带,而在叶片、老叶、和茎部未见明显表达。因此认为ZjGA2Oox基因的表达模式为组织特异性表达。日本结缕草在低温(4℃)、干旱(PEG6000)和高温(42℃)胁迫处理中,ZjGA20ox表达明显降低,而在盐(NaCl)和氧化(H2O2)胁迫中,ZjGA20ox表达分别在10h和5h出现峰值。此外,生理生化实验结果表明,外源赤霉素在植株处于低温胁迫时能够一定程度的缓解其受到的伤害,从而提高其抵抗能力。而植株在抗寒恢复过程中通过某种恢复机制促进ZjGA20ox基因表达上调,内源赤霉素合成量增加,促使植株能够很快恢复。