论文部分内容阅读
骨骼肌损伤的防治一直是运动医学领域中的热点和难点，其伤后炎症反应期长，愈合质量较差，容易形成瘢痕愈合。尽管国内在分子生物学领域已经取得一定进展，但是目前在临床仍未能找到预防和治疗骨骼肌损伤公认的最佳方案。 研究目的：本实验对ICR小鼠进行骨骼肌钝挫伤造模后，采用rAAV2介导的胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、人脐带血间充质干细胞(MSC)，对急性骨骼肌钝挫伤小鼠进行干预治疗，从组织学、生物化学等不同的研究层次和角度，探讨基因及间充质干细胞对骨骼肌损伤的治疗作用及可能机制，比较单纯基因治疗、单纯间充质干细胞、以及两者联合干预对骨骼肌钝挫伤小鼠的修复效果，丰富相应研究资料。 研究方法：动物分组与处理：将68只雄性ICR小鼠随机分为空白对照组（4只）和实验组（64只），实验组小鼠骨骼肌钝挫伤造模后平均分为四组，每组16只，各实验组又根据取材时间不同，分为伤后3天组，伤后7天组，伤后14天组，伤后21天组。基因治疗组（rAAV-IGF-Ⅰ）在造模后即刻用微量注射器注射40μL重组腺相关病毒，间充质干细胞组（MSC）注射106个细胞，联合治疗组(rAAV-IGF-Ⅰ-MSC)注射经腺相关病毒感染后的间充质干细胞106个，自然愈合组注射40μL PBS。 分别在损伤后3d、7d、14d、21d处死动物，眼球取血，留取血清，Eppendoff管密封保存于-80℃冰箱待测；速取损伤区域腓肠肌，用生理盐水将残留血液清洗干净，其中二分之一置于冻存管中在液氮中速冻3-4小时，然后转移至-80℃冰箱保存待测，另外二分之一肌肉用10％福尔马林固定，用于HE染色观察及免疫组织化学实验。 研究结果：（1）重组腺相关病毒介导的近红外荧光蛋白 iRFP713能够在受伤肌肉组织中广泛表达，对照组无表达。（2）HE染色光镜观察、血浆CK活性变化表明 MSC、rAAV-IGF-Ⅰ、rAAV-IGF-Ⅰ-MSC能促进小鼠急性腓肠肌钝挫伤后的肌肉再生，减少疤痕形成，提高愈合质量。（3）外源 IGF-Ⅰ能在小鼠腓肠肌中稳定表达，在第14d时，IGF-Ⅰ含量从高到低分别为rAAV-IGF-Ⅰ-MSC组、rAAV-IGF-Ⅰ组、MSC组、自然愈合组、安静对照组。（4）MSC、rAAV-IGF-Ⅰ、rAAV-IGF-Ⅰ-MSC能抑制骨骼肌钝挫伤小鼠局部组织Collagen-Ⅰ、Ⅲ mRNA的表达，第7d、14d、21d,Collagen-Ⅰ mRNA的表达量均低于自然愈合组（P＜0.01），第3d，rAAV-IGF-Ⅰ组与自然愈合组相比无统计学差异（P＞0.05），其余两组差异显著（P＜0.05）。第14d，rAAV-IGF-Ⅰ-MSC与 MSC组也表现出非常显著性差异（P＜0.01）。21天，rAAV-IGF-Ⅰ组是MSC组的76%（P＜0.01），rAAV-IGF-Ⅰ-MSC组是MSC组的58%（P＜0.01）。小鼠发生急性骨骼肌损伤3天和第7天时，各治疗组Collagen-Ⅲ mRNA的表达量与自然愈合组相比均有显著性差异（P＜0.01），组间无统计学差异（P＞0.05）。第14d，MSC组是自然愈合组的74%（P＜0.05），rAAV-IGF-Ⅰ组是自然愈合组的63%（P＜0.01），rAAV-IGF-Ⅰ-MSC组自然愈合组的42%（P＜0.01）。rAAV-IGF-Ⅰ-MSC组的Collagen-Ⅲ mRNA的表达量与MSC组相比也具有统计学差异（P＜0.05）。第21天，rAAV-IGF-Ⅰ、rAAV-IGF-Ⅰ-MSC两组的Collagen-Ⅲ mRNA的表达量均低于自然愈合组（P＜0.01）。 研究结论：（1）MSC及 IGF-Ⅰ对小鼠急性骨骼肌损伤有治疗作用（2）MSC对急性骨骼肌损伤小鼠腓肠肌作用时间较快，但作用持续时间较短（3）rAAV2介导的IGF-Ⅰ对急性骨骼肌损伤小鼠腓肠肌作用时间较慢，但作用持续时间长久（4)rAAV-IGF-Ⅰ-MSC治疗组要优于单纯MSC和rAAV-IGF-Ⅰ治疗组。