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隐孢子虫病是重要的、最常见的人兽共患原虫病之一,由隐孢子虫感染引起,广泛流行于全球范围。隐孢子虫感染人在内的近300种动物,通过多种途径传播,主要传播途径为直接接触病原。腹泻是隐孢子虫病主要临床症状。野生动物隐孢子虫病显示出潜在的人兽共患威胁,近一半虫种与基因型在野生动物上确认,显示分子流行病学对调查野生动物隐孢子虫种类的必要性与重要性,从而为评价其传染力度提供数据。然而,位于盆地的四川省,尚无野生动物隐孢子虫病的调查报道。现今,仍无有效药物治疗隐孢子虫病,增加了防治隐孢子虫病的难度,绿色解决方案就是发展疫苗而控制隐孢子虫病感染。食品级乳酸乳球菌具有黏附力强、直接口服、安全性高、成熟的抗原呈递系统及诱导肠道黏膜免疫等优势,成为研制隐孢子虫口服疫苗优秀的候选活载体。本研究包括以下四部分:试验一、四川省圈养野生动物隐孢子虫感染检测本研究从2012至2015年收集四川省不同地区、不同圈养野生物种（约130种）新鲜粪便2678份,采用饱和蔗糖漂浮法和巢式PCR扩增粪便粗卵囊DNA的隐孢子虫18S rRNA基因检测隐孢子虫感染。结果显示,5种野生动物的13份粪便感染隐孢子虫,分别为竹鼠源隐孢子虫3株（YA01、YA02、YA03）、骆驼源隐孢子虫3株（源自2只骆驼）（SCBC02、CDBC01）、松鼠猴源隐孢子虫1株（SCSM01）、野猪源隐孢子虫3株、小香猪源隐孢子虫3株。试验二、四川省圈养野生动物隐孢子虫基因型、亚型鉴定以试验一阳性粪便基因组DNA为模板,经巢式PCR扩增其18S rRNA、HSP70、COWP及actin基因型序列及gp60与MLST亚型基因（MS1、MS2、MS3、MS16）,通过序列比对校正、同源性分析及邻接法（NJ）或最大似然法（ML）构建发育树确定种系进化关系,鉴定阳性隐孢子虫基因型和亚型。结果表明:1.YA01、YA02、YA03分离株与微小隐孢子虫（C.parvuw）相比在18SrRNA位点存在1-5个核苷酸差异,HSP70与actin位点分别有14、17、11和4、4、9个核苷酸置换。Cparvum COWP基因和YA01、YA02 一致,而与YA03显示出2个核苷酸突变。各基因同源性均>99%。邻接树（NJ）显示相似拓扑结构,3个虫株均与Cparvum 类聚在一起,表明竹鼠感染C.parvuw。YA03与瑞典腹泻病人亚型IIoA16G1拥有98.6%同一性但缺少3个TCA重复,属于Ilo家族,为IIoA13G1,同时首次证明IIo是人兽共患亚型。YA01与YA02具有相同gp60序列、拥有9个TCA重复、跟C.parvum亚型IInA8（FJ897785）相比仅占有93.9%的最大同源性且呈现广泛序列多态性。NJ发育树显示YA01、YA02形成一单独族群,为C.parvum新亚型家族IIpA9。2.SCBC02、CDBC01分离株18SrRNA与COWP基因序列与安氏隐孢子虫（C.andersoni）相似性均为100%,且与C.anderson 在同一发育支,表明骆驼隐孢子虫均为C.anderson.对于 MLST 亚型,SCBC02 与牛源C.andersoni.A4、A4、A4、A1亚型和CDBC01与骆驼源C.andersoni A6、A5、A2、A1亚型同源性均为100%。系统进化分析证实各亚型进化地位。3.SCSM01分离株COWP基因与兔隐孢子虫（C.cuniciulus）、人隐孢子虫（C.hominis）及猴基因型（monkey genotype）一致。18SrRNA、HSP70 及 actin 序列最大碱基差异数分别为2、10、6,明显多于monkey genotype与C.hominis碱基差异数-2、3、3。SCSM01 RFLP-PCR结果趋向C.ho,omos。NJ法在基因型位点产生不一致拓扑结构。在18S rRNA与COWP位点,SCSM01和C.hominis组合成一支族群,但不跟monkey genotype类聚一起;在HSP70基因单独形成一发育枝;actin位点先与monkey genotype聚集在一进化枝,之后与C.hominis形成一大族群。最大似然法（ML）产生的拓扑结构跟NJ法相匹配;基于遗传分化,SCSM01为区别于猴基因型的人隐孢子虫变种-猴基因型Ⅱ。gp60基因序列跟Chominis亚型IdA10G4最大同源性仅88.3%,远低于已知C.hominis亚型间同源性,在NJ与ML法拓扑结构树上分类地位相似且单独进化,确认一个新C.hominis亚型家族,IkA7G4。4.野猪与小香猪隐孢子虫18SrRNA序列与种猪隐孢子虫(Cscrofarum 同源性100%。而野猪隐孢子虫HSP70基因与泛在隐孢子虫（C.ubiqitum）相似性为100%,且和Cubiquitu 处在同一进化枝;小香猪隐孢子虫HSP70基因在猪隐孢子虫（Csuis）发育支上,暗示均存在混合感染。试验三、隐孢子虫食品级乳酸乳球菌疫苗株构建本研究提取隐孢子虫RNA,反转录为cDNA;设计包含酶切位点用于连接乳酸乳球菌（L.lactis）表达载体pNZ8149与大肠杆菌（E.coii）表达载体pET-32a的P23基因引物,分别T克隆并测序鉴定;提取含不同酶切位点T质粒并纯化P23基因;与载体pNZ8149连接获得目标质粒P23-pNZ8149,电转入I.lact.sNZ3900,构建食品级隐孢子虫L.lactis P23-pNZ8149/NZ3900重组菌株,并筛选鉴定。P23基因与载体PET-32a连接构成P23-pET32a质粒,热应激转入E.coli BL21构建E.coli P23-pET32a/BL21 重组菌株。以 10ng/mL 乳链菌肽（nisin）诱导 P23-pNZ8149/NZ3900菌株3h、6h、9h、12h,通过SDS-PAGE检测目的蛋白、最佳诱导时间及菌液密度（OD600）。ITPG诱导E.coliP23-pET32a/BL21菌株并免疫家兔,收集血清作为抗体,经Western-blot与间接免疫荧光试验（IIF）检测重组L.lactis P23-pNZ8149/NZ3900菌株表达P23蛋白的免疫原性和分泌蛋白所在位置。结果表明:1.成功构建P23基因T克隆载体,经测序,333bp的P23基因序列显示1个碱基突变,但对应氨基酸序列无变异。2.成功构建重组食品级隐孢子虫乳酸乳球菌P23-pNZ8]49/NZ3900。3.成功构建重组大肠杆菌表达菌P23-pET32a/BL21。4.经nisin诱导重组L.lactisP23-pNZ8149/NZ3900菌株,成功表达蛋白P23,分子量大小为23kDa,证明表达蛋白以糖基化形式存在。9h为最佳诱导时间,且OD600=2.7;空载体及未经诱导重组菌株均未表达目标蛋白。5.经ITPG诱导E.coli P23-pET32a/BL21菌株,蛋白P23正常表达,大小为38kDa（带标签）。未诱导重组菌无表达。6.通过 Western-blot 与 IIF 试验,重组L.lac is P23-pNZ8149/NZ3900 菌株表达P23蛋白显示较好免疫原性且分泌在菌体细胞表面。试验四、重组L.lactis P23-pNZ8149/NZ3900菌株对小鼠免疫指标初步评估以构建的隐孢子虫食品级L.lactis P23-pNZ8149/NZ3900菌株口服免疫10周龄BALB/c小鼠,免疫剂量为10i0CFU/d/只,连续5d（第一次为0d）,之后第5d、10d、15d、20d分别眼球采血处死3只,并取脾脏、肠道、粪便。采用间接ELISA检测血清中IgG、IgA、IgGl含量与细胞因子IL-4、IL-12、TNF-α、IFN-γ活性,脾脏细胞因子IL-4、IL-12、TNF-α、IFN-γ和T细胞CD4+、CD8+浓度,肠黏液与粪便抗体slgA与IgM含量。同时设立阴性对照pNZ8149/NZ3900空载体菌与空白对照PBS,结果表明:1.小鼠免疫后,肠黏膜与粪便sIgA与IgM较阴性和空白组显著升高（p<0.01）,且逐步增加,表明食品级L.lacti P23-pNZ8149/NZ3900活载体疫苗株可高效递呈P23蛋白刺激肠黏膜免疫系统,诱导肠黏膜免疫反应,展示较好免疫原性。阴性组略微升高,但较空白组无统计学差异（p>0.05）。2.小鼠血清IgG、IgA、IgG1与IL-4、IL-12、TNF-a、IFN-y含量均明显上升（p<0.01）且至检测结束仍在增加;阴性与空白组无显著差异（p>0.05）,指示出构建的重组L.lctisP23-pNZ8149/NZ3900菌株可有效引起小鼠体液免疫。3.脾脏IL-4、IL-12、TNF-α、IFN-γ及CD4+、CD8+浓度变化趋势与血清指标一致（p<0.01）,CD4+/CD8+缓慢升高但差异不显著,证明重组L.lactis P23-pNZ8149/NZ3900菌株有效诱导小鼠细胞免疫,引发Thl型与Th2型免疫反应同步进行,且细胞免疫反应以CD4+增加为主。综上所述,①首次较大范围对川内圈养野生动物隐孢子虫感染情况进行调查,没有显示出人兽共患的威胁,分离的隐孢子虫呈现出遗传多样性。②成功构建分泌具有生物活性P23蛋白的隐孢子虫食品级L.lactis P23-pNZ8149/NZ3900疫苗株,通过小鼠免疫试验表明食品级L.lactis P23-pNZ8149/NZ3900疫苗株呈递P23蛋白,有效刺激肠道黏膜免疫、体液免疫及细胞免疫,为防治隐孢子虫病绿色食品级疫苗的大范围推广应用研究奠定了良好的基础。