肝脏不仅参与物质代谢，还具有分泌、排泄、解毒等重要功能。因此，肝脏功能发生异常还会导致其他重要器官的代谢和功能受损如肝性脑病、肝肾综合征等。肝脏的缺血再灌注损伤（hepatic ischemia reperfusioninjury，HIRI）是目前临床上经常遇到的一个棘手问题。有研究表明它不仅是导致肝功能衰竭，病人愈后较差的重要原因，还可使远端器官如心脏处于高度氧化应激状态，导致心肌细胞遭受过氧化损伤。　　 氧化应激损伤是由活性氧族(reactive oxygen species:ROS)造成的。ROS包括超氧阴离子(O2-.)，过氧化氢(H2O2)和羟自由基(OH.)。因其化学性质非常活泼，可以破坏细胞内的重要结构蛋白和功能蛋白，并能改变细胞膜的结构，从而影响细胞功能，甚至引起细胞和组织死亡。PrxⅥ是近几年发现的一类过氧化物酶系Peroxiredoxin(Prx)的家族成员之一。它在多种组织表达，其中肺和脑表达最多。研究表明PrxⅥ具有谷胱甘肽过氧化物酶的生物活性，其功能主要是负责还原H2O2和磷脂过氧化物等。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases，SOD)、过氧化氢酶(Catalases，CAT)也是机体内清除ROS的重要酶系，SOD能够清除O2-.，而CAT主要负责清除脂类代谢过程中产生的H2O2。　　 脑组织和心肌都是机体内对氧含量高度敏感的器官，当肝脏缺血再灌注损伤发生后，脑组织是否也会受到氧化应激损伤？PrxⅥ、SOD和CAT等抗氧化酶的基因水平如何改变？未见报道。　　 本研究通过无损伤血管夹夹闭通往大鼠肝左叶、肝中叶的血管和胆管蒂30 min后松开血管夹，制造大鼠70％肝脏缺血再灌注损伤模型，然后观察大鼠脑内MDA水平，PrxⅥ的mRNA和蛋白表达水平、SOD和CAT的mRNA表达水平及活性改变，探讨肝脏缺血再灌注损伤后脑内的氧化应激状态以及PrxⅥ、SOD和CAT的抗氧化作用。　　 目的:　　 观察大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型脑内的氧化应激水平以及PrxⅥ、SOD和CAT抗氧化体系的表达及活性改变，探讨其在脑内抗氧化应激反应中的作用。　　 方法:　　 1.肝脏缺血再灌注损伤模型的制备及取材选用健康雄性Wistar大鼠，体重200±10g，由河北医科大学实验动物中心提供。随机分为对照组(Con)和缺血再灌注损伤组(HIPI)，用6％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（0.5ml/kg），参照Kohli等人的方法，分离肝血管和胆管蒂，以无创伤性血管夹夹闭通往肝左叶、肝中叶的血管和胆管蒂。30分钟后去掉血管夹，恢复肝脏血液供应，制造70％肝实质的肝脏缺血再灌注损伤模型。对照组大鼠只分离血管和胆管蒂并不夹闭。6小时后收集血液，用于ALT（丙氨酸氨基转移酶）测定;处死大鼠取肝脏和脑，一部分4％多聚甲醛中固定进行HE染色，观察肝组织和脑组织的形态学改变，一部分置于液氮中用于脑组织PrxⅥ、SOD和CAT mRNA水平、蛋白水平、抗氧化活性和MDA含量测定。　　 2.测定指标及方法　　 2.1 HE染色观察大鼠肝脏和脑组织的形态结构肝脏和脑组织经常规脱水、透明，石蜡包埋后，切片厚约5μm，苏木精伊红染色，日本产Olympus光学显微镜下观察肝组织和脑组织形态变化并进行图象分析。　　 2.2 血清ALT水平测定未抗凝血经3000rpm离心10min分离血清，血清ALT水平由全自动生化分析仪测定。　　 2.3 脑匀浆的制备和MDA含量测定从-70℃冰箱中取出脑组织，按照10mg/100μl加入预冷的匀浆缓冲液(50mmol/L磷酸钾缓冲液，PH7.4，lmmol/L盐酸苯甲脒，1mmol/L PMSF，0.1％Tween-20,0.5mol/LNaCl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巯基乙醇），冰浴中匀浆，匀浆液4000rpm4℃离心20min，取上清即制成10％脑组织匀浆，脑组织匀浆内MDA含量经南京建成丙二醛(MDA)测定试剂盒测定。　　 2.4 大鼠脑组织PrxⅥ、SOD和CATmRNA水平测定用TRIzol法提取脑内总RNA。约3μg总RNA反转录成cDNA。以GAPDH为内对照，进行RT-PCR。分别以PrxⅥ、SOD、CAT的扩增产物与GAPDH灰度值之比表示目的基因的相对表达量　　 2.5 脑组织内CAT和SOD的活性测定CAT活性参照Aebi H的方法测定，SOD的活性采用南京建成生物公司试剂盒测定。CAT和SOD的活性均以每毫克样本蛋白所含的酶活性单位数(U/mg pro)表示，蛋白定量采用改良的Lowry法。　　 2.6 脑组织内PrxⅥ蛋白水平测定采用Western blot法测定大鼠脑内PrxⅥ蛋白水平。将大鼠脑组织制成匀浆，离心后取上清。用改良Lowry法进行蛋白总量测定，电泳的蛋白上样量为68 ug.经过转膜和封闭处理后，在PVDF膜上加入兔抗PrxⅥ抗体，室温静置过夜。再加入辣根过氧化物酶标记抗兔IgG抗体.按发光试剂操作说明进行显影，定影，晾干。用凝胶成像系统扫描胶片并分析图像，以条带的积分光密度值表示其蛋白含量。　　 结果:　　 1.大鼠肝组织和脑组织的形态学改变光学显微镜下可见Con组大鼠肝细胞排列成条索状，围绕中央静脉成放射状排列，肝索间肝血窦大小均匀，无明显扩张充血。而HIRI组大鼠的肝组织淤血严重，肝血窦明显扩张充血，肝细胞受压萎缩，肝细胞胞浆染色变浅且有空泡出现，部分肝细胞水肿明显，体积增大，染色变浅。脑组织在光学显微镜下两组间未见明显形态结构变化。　　 2.血清ALT水平Con组大鼠血清中ALT为20.03±5.23U/L，而HIRI组血清ALT为87.43±9.06 U/L。HIRI组大鼠血清ALT水平明显高于Con组(P＜0.01)。　　 3.脑匀浆内MDA的含量Con组大鼠脑内MDA的含量为7.07±1.24mmol/g，而HIRI组血清MDA含量为12.37±2.13mmol/g。HIRI组大鼠脑内MDA的含量明显高于Con组（P＜0.01）　　 4.脑组织PrxⅥ、SOD、CAT mRNA相对表达量采用RT-PCR的方法测定大鼠脑组织内PrxⅥ、SOD、CAT抗氧化酶系mRNA的表达量。计算与内参照的比值得出相对表达量进行结果统计。分析表明:HIRI组大鼠脑组织内的PrxⅥ、SOD、CAT的mRNA水平均明显高于Con组（P＜0.05）。说明HIRI组大鼠脑组织内PrxⅥ、SOD、CAT抗氧化酶系表达升高。　　 5.大鼠脑组织内SOD和CAT活性Con组大鼠脑组织内SOD和CAT活性分别为228.07±22.4U/mg pro和28.5±1.61 U/mg pro，HIRI组分别为323.22±21.4U/mg pro和49.16±5.13U/mg pro。HIRI组大鼠脑组织内SOD和CAT活性明显高于对照组（P＜0.01）　　 6.大鼠脑组织内PrxⅥ的蛋白水平HIRI组大鼠脑组织内PrxⅥ的蛋白表达水平（1.37±0.16）明显高于对照组（0.79±0.12）(P＜0.01)。　　 结论:　　 1.结扎肝左、中血管和胆管蒂可成功建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型。　　 2.大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型脑组织的形态结构虽未发生明显改变，但此时脑组织已遭受氧化应激损伤。　　 3.PrxⅥ、SOD和CAT在大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型脑组织中的基因水平、蛋白水平和抗氧化活性均明显增强，提示它们发挥了抗氧化应激作用。