背景和目的背景:炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）是一种病因及发病机制尚不明确的非特异性慢性肠道炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s disease,CD）。IBD的特点是慢性、反复性、迁延性发展进程,并可能出现诸如肠纤维化及癌变等严重并发症。目前研究表明,多种因素如感染、化学和物理刺激及自身免疫性疾病能够增大癌变的风险。炎症性肠病相关结直肠癌（colitis-associated cancer,CAC）是与IBD患者预后及生存期密切相关的重要并发症之一,死亡率高,但目前尚未发现有效的预防及治疗方案。UC主要累及远段结肠和直肠黏膜,向近段发展,临床表现主要有腹痛、腹泻和黏液脓血便。CAC主要发生在UC患者中。CAC的分子机制现仍不明确,对于散发性结直肠癌的发病机制,目前主流观点是DNA突变积累导致正常黏膜-不同阶段腺瘤-癌变。然而,IBD相关CRC不依照“腺瘤-癌变”的经典模式,炎症性肠病癌变过程为“炎症-不典型增生-癌变”途径,可进一步拆分为:炎症-可疑异型增生-轻度非典型增生-重度非典型增生-癌变。在此过程也可跳过其中的一个或多个阶段,或呈多中心发展（multifocal dysplasia）。上皮间充质转化（Epithelial Mesenchymal Transition,EMT）系指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间充质细胞转化的现象。目前认为EMT参与各种炎症中的组织纤维化及多种肿瘤的侵袭、转移过程。EMT可分为三种不同的功能类型,其中III型EMT能够参与及促进肿瘤的浸润和转移。在III型EMT中,异常上皮细胞失去原有的形态并具备间质细胞的高度可迁移性,使细胞获得肿瘤恶性和转移浸润的表型,出现早期恶性病变的特征。EMT的主要特点是上皮细胞表面标志物表达下降（E-cadherin、α-catenin、Zo-1、细胞角蛋白、黏蛋白等）,而间质细胞表面标志物表达上升（Vimentin、FN、N-cadherin、α-sma、基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9等）。其中,E-cadherin的表达丢失是EMT最重要的标志。诱导EMT的信号通路包括TGF-β信号通路、Smad2/3通路、Wnt信号通路及Notch信号通路等。诱导EMT发生的信号通路十分复杂,并且各个肿瘤相关信号分子的正负反馈过程也参与其中。其中TGF-β是在EMT过程中的关键介质,在癌症进展早期阶段,TGF-β作为肿瘤生长抑制因子能够抑制肿瘤细胞的增殖和分化。Smad2/3在TGFβ诱导发生EMT的过程中起着重要作用。TGF-β刺激上皮细胞后的经典信号通路是与胞膜上的TGF-βI型和II型受体结合形成配体受体复合物,进而结合并磷酸化Smad蛋白家族中的Smad2/3,磷酸化后的Smad2/3与胞浆中的Smad4形成复合物并发生核转位,复合物进入细胞核后与EMT相关基因启动子区的Smad结合元件相结合而调节α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、结缔组织生长因子（CTGF）、基质金属蛋白酶2（MMP2）、Snail和Smad相互作用蛋白1（SIP1）的相关靶基因的表达。Syndecan-1（Sdc1）全称是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（Heparan Sulfate Proteoglycan,HSPG）,包含有硫酸乙酰肝素（HS,Heparan Sulfate）及硫酸软骨素链修饰的I型跨膜核心蛋白,主要分布于上皮细胞、少量分布于血管内皮细胞及浆细胞表面。Sdc1的胞外结构域与细胞外基质多种调节分子结合,通过激活内部和外部的各种调节信号参与多种疾病的发病机制。Sdc1可以调节白细胞聚集,肿瘤增殖和侵袭,血管生成,病原微生物附着和侵入及宿主防御机制。Sdc1在炎症性疾病中,如肺损伤、脓肿、哮喘及炎症性肠病等通过改变白细胞粘附、免疫激活及基质重建发挥调节作用。细胞表面Sdc1的下调会延缓上皮修复过程,并可能使得炎症反应变得长期及反复。另外,Sdc1脱落的增高可能抑制促进白细胞归巢和组织修复等人体必需的过程。Syndecan-1介导的细胞间黏附破坏在结直肠癌的发病机制中可能起关键作用。在生理条件下,Syndecan-1有助于细胞上皮形态维持,增加细胞黏附力,并且sdc1表达与粘附分子E-cadherin的表达呈正相关,其表达的脱落可能促使E-cadherin表达下降。Sdc1表达丢失能够破坏细胞间黏附,与结直肠癌的恶性程度,侵袭转移及肿瘤分期密切相关,在此过程中可能参与了 EMT的诱导和发生,但二者的相互作用关系并未得到进一实的证实。低分子肝素治疗可以缓解蛋白丢失性肠病及炎症性肠病相关的炎症症状,Sdc1可能通过其HS来起到维护作用的。由于肝素的结合位点有相似特性,因此它可以与IFNγ和TNFα结合并抑制其活性,甚至肝素可以替代多种HSPG的生物学功能。Sdc1与EMT关系的研究比较少。Sdc1在细胞膜上的表达有助于维持正常肠粘膜肠腺上皮细胞的形态,Sdc1的脱落能够使细胞形态及功能发生改变,而在EMT过程中,极化的上皮细胞失去正常形态,细胞间连接减少,进而转变为间充质样细胞形态,从而发生细胞上皮细胞表型向间质细胞表型转变。有研究表明Sdc1的脱落可以诱导乳腺上皮细胞发生EMT,且sdc1与E-cadherin的表达水平呈正相关性,而E-cadherin表达下降是发生EMT最重要的标志性变化。纤维母细胞也参与了 Syndecan-1的表达及影响EMT发生。因此Sdc1及EMT都参与改变上皮细胞与细胞间粘附及连接,Sdc1的丢失可能发生EMT,但是在肠癌发生机制中仍未有研究。目的:观察低分子肝素是否通过抑制EMT而阻止炎症性肠病发生癌变,进而探讨低分子肝素能否通过抑制sdc1脱落而在治疗炎症性肠病癌变中发挥作用。材料和方法:1.主要材料:大鼠隐窝上皮细胞IEC-6（ATCC,Manassas,VA）,大鼠抗E-cadherin抗体（美国Abcam公司）,兔抗Vimentin抗体（美国Abcam公司）,兔抗Sdc1抗体（美国Abcam公司）,兔抗smad2/3抗体（CST公司）,Transwell小室及细胞,培养板（Coming公司）,CCK-8试剂盒（日本同仁）,溴化乙锭（PI）（Sigma-Aldrich公司）,雄性Balb/c小鼠（南方医科大学实验动物中心）。Lenti-sdc 1-shRNA（上海吉凯）,氧化偶氮甲烷（Azoxymethane,AOM）Sigma-Aldrich 公司,葡聚糖硫酸钠（Dextran Sodium Sulfate,DSS）MP biomedicals 公司,（克赛）依诺肝素钠（SANOFI WINTHROP INDUSTRIE）。2.方法2.1 IEC-6在不同浓度TGF-β刺激下形态变化及EMT现象将IEC-6培养于预先加好1%血清的培养基的六孔板中,向每孔加入TGF-β,使每孔中受浓度梯度增高的TGF-β刺激,浓度依次为Ong/ml,10ng/ml,20ng/ml,30ng/ml,40ng/ml和50ng/ml,作用48小时,实验重复三次,显微镜下观察细胞形态改变,western blot,免疫荧光检测E-cadherin,vimentin和syndecan-1蛋白的表达;2.2在IEC-6细胞稳定转染两种不同序列Lenti-sdc1-shRNA及空白载体慢病毒,观察形态及EMT现象将IEC-6消化后以铺约1000个细胞于96孔板每孔中,各孔分别加入0.5ul,1ul,5ul,10ul慢病毒稀释液,按细胞比例转染两组不同敲除序列的sdc1-shRNA1及sdc1-shRNA2包装好的慢病毒转染IEC-6,成功后提取细胞蛋白,在显微镜下观察细胞形态,Westerin blot,荧光定量PCR检测转sdc1-shRNA1及sdc1-shRNA2的IEC-6细胞的sdc1及EMT标志物E-cadherin及Vimentin的蛋白表达水平及水平。2.3 Transwell检测稳定转染Lenti-sdc1-shRNA的IEC-6细胞侵袭能力用预先铺好Matrigel的Transwell板检测稳定转染Lenti-sdc1的IEC-6细胞的侵袭能力,每孔铺入约1×104细胞于Transwell上室,与12小时,24小时,36小时分别终止多聚甲醛用0.1%结晶紫染色后,显微镜下结晶紫染色计数,计算下层的细胞总数。2.4 PI检测稳定转染Lenti-sdc1-shRNA的IEC-6细胞周期改变将转染了Lenti-sdc1-shRNA及空白载体慢病毒的两组细胞,在实验前一天铺至细胞板中,20℃预冷的70%乙醇,于4℃固定过夜,第二天上机检测并分析。2.5 CCK-8检测转染Lenti-sdc1-shRNA的IEC-6细胞增殖能力Lenti-sdc1-shRNA及空白慢病毒的IEC-6细胞增殖能力,分别取时间段为12小时,24小时,36小时及48小时检测CCK-8的OD值,用析因分析统计方法分析。2.6划痕实验检测转染lenti-sdc1-shRNA的IEC-6细胞迁移能力将转染稳定转染Lenti-sdc1-shRNA干扰慢病毒及空白慢病毒的IEC-6细胞株铺至6孔板中,待融合度达100%时进行划痕。对不同时间点的划痕宽度进行比较2.7低分子肝素抑制sdc1表达下调后在上皮间质转化中的作用在长有60%融合度的IEC-6的六孔板中,分别依次加入0 ng/ml、10ng/ml TGFβ、20ng/ml TGFβ、20ng/ml TGFβ+20ul 低分子肝素、20ng/ml TGFβ+20ul低分子肝素和20ng/ml TGFβ+20ul低分子肝素刺激IEC-6细胞48小时,然后收集蛋白用 western blot 检测syndecn-1,Ecadherin,Vimentin,p-smad2,smad2 的表达水平。2.8 Transwell检测应用低分子肝素于发生EMT的IEC-6的侵袭能力将IEC-6铺于六孔板中,分为以下三组20ng/ml TGF β、20ng/ml TGF β+30ul LMWH及空白对照组,细胞被刺激48小时后移至transwell小室中,每孔计数10000细胞,于30小时后中止细胞侵袭,结晶紫染色后计数下层细胞数从而反映细胞侵袭能力。2.9划痕实验观察应用低分子肝素于发生EMT的IEC-6的迁移能力将IEC-6铺于六孔板中,分为以下三组20ng/ml TGFβ、20ng/ml TGFβ+LMWH及空白对照组,融合率达100%后进行划痕,对0小时,36小时的划痕宽度比例进行比较。2.10低分子肝素抑制sdc1脱落在炎症性肠病相关性结直肠癌小鼠模型上皮间质转化中的作用取57只6-8w雄性Balb/c小鼠,随机分成四组,空白对照组,12只,癌变对照组21只,早期肝素治疗组12只,晚期肝素治疗组12只,除了空白对照组腹腔注射相应量的生理盐水,其它组进行腹腔注射AOM（12.5mg/kg/只）,注射AOM后自来水喂养一周,改饮用3%DSS 1周,每3天更换DSS,一周后再改饮用自来水2周。后再按以上方案重复三个循环。在开始喂DSS的第0天,第3周,第9周,第6周,第12周,第16周时,癌变对照组随机处死3-6只,而其它组（空白对照组,早期肝素治疗组和晚期肝素治疗组）在喂DSS的第6周,第9周,第12周,第16周每组随机处死2-4只小鼠,每周进行疾病活动指数评分,处死后取肠道组织,清数肿瘤数目,记录肠道长度,肠道重量,提取肠道组织进行western blot、HE染色和免疫组化。2.11统计学分析:采用SPSS13.0统计软件细胞增殖用析因分析,侵袭转移采用独立实验t检验,DAI比较运用重复测量分析,多组独立样本比较采用单因素方差分析（onewayANOVA）进行统计学处理,以P<0.05为差异具显著性。结果1.分别用不同浓度梯度增高的TGF-β,0ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,30ng/ml,40ng/ml和50ng/ml刺激IEC-6细胞48小时后在显微镜下观察显示,随着刺激因子浓度的增高,细胞形态由正常规则的圆形、球形向纺锤形及梭形改变,并且细胞形态不一,有些细胞伸出触角,将变形细胞的百分比在显微镜低倍境下肉眼估算,分别为0%,20%,70%,70%,70%,80%,当刺激因子达到20ng/ml的浓度时,变形细胞的比例并没有明显增高2.使用western blot检测syndecan-1、E-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平。发现伴随TGF-β刺激浓度的梯度升高,sdc 1和上皮细胞表面标志物E-cadherin的表达水平逐渐下降（F=259.199,P<0.001;F=109.846;P<0.001）,同时间质细胞表面标志物Vimentin表达水平梯度升高（F=117.752,P<0.001）。E-cadherin和syndecan-1在TGF-β浓度为20ng/ml与未经处理的细胞表达下降显著（P<0.001）。3.用20ng/mlTGF-β刺激后的细胞进行免疫荧光检测,同组蛋白检测的爆光时间皆一致时,我们能够看到E-cadherin和syndecan-1在IEC-6细胞荧光强度较弱,在TGF-β刺激后荧光更加不明显,TGF-β刺激后IEC-6中Vimentin荧光变强。4.两组不同敲除序列的sdc1-shRNA1及sdc1-shRNA2病毒质粒包装好的慢病毒转染IEC-6,在显微镜下观察细胞形态,可见细胞转染Lenti-sdc1-shRNA1及Lenti-sdc1-shRNA2的细胞形态改变,转染了后者的细胞形态发生显著改变。5.IEC-6转染Lenti-sdc1-shRNA2后,sdc1 的表达明显 降低（F=597.410,P<0.001）,而转染Lenti-sdc 1-shRNA1的细胞sdc1表达未见显著下调。6.荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）验证转染Lenti-sdc1-shRNA2的IEC-6 细胞中 sdc1、E-cadherin 和 Vimentin 的 mRNA 水平改变,转染了Lenti-sdc1-shRNA2的IEC-6细胞的sdc1的mRNA水平明显较空白对照组低（t=7.263,P<0.005vs control）,而 E-cadherin 的 mRNA 水平明显低于对照组（t=3.631,P<0.05vs control）,Vimentin 的 mRNA水平显著高于空白对照组（t=9.900,P<0.001 vs control）。7.Lenti-sdc 1-shRNA转染IEC-6后的下层细胞数较对照组细胞增加,侵袭能力明显增强。两组间存在明显差异（t=13.229,P<0.001）,Lenti-sdc1-shRNA转染IEC-6后的细胞侵袭力更强,大约为对照组的1.5倍。8.CCK-8法检测转染了 Lenti-sdc 1-shRNA及空白慢病毒的IEC-6细胞增殖能力,发现转染了 Lenti-sdc1的IEC-6细胞与转染了空白慢病毒的对照组比较,增殖能力有明显差异（p<0.001）。在12小时、24小时Lenti-sdc1-shRNA及空白慢病毒的IEC-6的细胞增殖能力并没有差异（12小时:F=0.576,p=0.465;24小时:F=1.219,p=0.295）,24小时以后,sdc1敲低组的增殖明显增快（36小时,F=109.557 p<0.001:48小时:F=6.235,p=0.032）。9.划痕实验检测转染了 Lenti-sdc1-shRNA及空白慢病毒的IEC-6细胞迁移能力。在0h时,对照组细胞和转染了 Lenti-sdc1-shRNA两组细胞划痕宽度相近,36h后,转染了 Lenti-sdc1-shRNA慢病毒的细胞划痕宽度较对照组窄。Lenti-sdc 1-shRNA组细胞较对照组细胞,其划痕宽度比值（划痕36h与0h后）显著降低（t=8.436 P=0.001）。10.20ng/ml的TGFβ刺激细胞的背景下分别加入10ul,20ul,30ul及40ul的低分子肝素（LMWH）。TGFβ浓度为20ng/ml时能够成功诱导发生EMT,E-cadherin下调表达（F=272.730,P<0.001）及Vimentin表达增强（F=33.855,P<0.001）,同时随着肝素浓度的增高而升高,sdc1的蛋白表达有增高的趋势,在同时加入20ug/mlTGFβ和40ul LMWH的孔中sdc1蛋白表达较单纯用20ng/ml TGFβ刺激组的增高显著（F=635.490,P<0.001）。同时我们发现E-cadherin和Vimentin在同时加入20ug/ml TGFβ和40ul LMWH的孔中分别升高和下降最为显著（F=272.730,P<0.001;F=33.855,P<0.001）。11.Smad2磷酸化在单纯加入20ng/ml的TGFβ的细胞中最为显著。Smad2磷酸化随着TGFβ浓度（10ng/ml、20ng/ml）的增高而逐渐增强,而随着低分子肝素干预浓度的增高,Smad2磷酸化则逐渐减轻（F=249.713,P<0.001）。.12.AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型的DAI评分比较,重复测量结果显示第1周至第12周,不同时间点各组间DAI有显著差异（F=10.240,P<0.001）,同组间不同时间点存在显著差异（F=94.358,P<0.001）,同时间点不同组间也存在差异（F=48.055,P<0.001）。13周至16周,同一时间点不同组间都有统计学差异（P<0.05）,两两比较,肠癌对照组及晚期治疗组的DAI评分与空白对照组比较有显著差异（P<0.05）而早期治疗组DAI评分与空白对照组未见统计学差异。,12周及16周的模型成瘤率为为100%,且68.6%位于结肠末端;25.7%位于结肠中段。13.模型小鼠结肠组织HE染色石蜡切片后显微镜下观察模型小鼠结肠组织HE染色石蜡切片后显微镜下观察,用肠癌模型组不同时间段的组织进行对比,发现造模时间越久,肠粘膜表现3周至16周由轻度不典型增生-中度不典型增生-重度不典型增生-腺癌改变。HE可见肠上皮细胞在6周至8周主要以中高度不典型增生为主,10周后细胞异型性明显,排列紊乱,紧密呈复层化,细胞核增大呈多形性,占据大部分细胞,癌成巢分布,无明显腺腔形成,细胞核的分裂相增多,形成腺样不规则结构。模型小鼠结肠癌肿的病理学。分类以高分化腺癌为主。14.对各组小鼠进行免疫组化检测sdc-1,vimentin及E-cadherin的表达强度,我们发现,空白对照组和早期治疗组中小鼠肠上皮细胞syndecan-1和Ecadherin 表达强度皆较癌变对照组高（syndecan-1:F=26.684,P<0.001;Ecadherin:F=29.320,P<0.001）,并且表达位置主要位于上皮细胞胞膜表达及少量细胞胞浆表达（图3-4）;同时,空白对照组和早期治疗组中小鼠肠上皮细胞Vimentin表达强度皆较癌变对照组低（F=38.933,P<0.001）,vimentin在对照组和治疗组Vimentin的表达较低,主要位于上皮细胞胞浆,而在癌变照组,我们可以看到Vimentin主要表达在癌细胞,且表达强度高。15.Western blot检测检测癌变对照组和早期治疗小鼠的sdc1,vimentin,及E-cadherin表达水平变化,6周前,肠癌对照组的小鼠肠道E-cadherin表达水平不变且较高,于6周后E-cadherin表达下降,至12-16周表达水平最低,而在16周早期治疗组,E-ecaderin的表达逐渐升高（F=43.010,P<0.001）。6周前,肠癌对照组的小鼠肠道Vimentin蛋白表达水平较弱,6-9周后vimentin则逐渐升高,而16周早期治疗组中vimentin表达则减弱（F=11.099,P<0.001）。在肠癌对照组中,小鼠肠道Sdc1于第3周表达缺失和下降,早期治疗组16周时表达水平升高（F=29.158,P<0.001）。结论:1.敲低Syndecan-1表达能够诱导正常肠上皮细胞IEC-6出现EMT现象,E-cadherin下调,Vimentin上调表达,敲低Syndecan-1表达的细胞形态改变,伴随细胞侵袭力,迁移力和增殖力增强。2.低分子肝素能够抑制syndecan-1的表达,从而抑制EMT的发生,这个过程可能与低分子肝素间接或者直接阻断smad2通路有关。3.低分子肝素能够抑制发生EMT后IEC-6细胞侵袭能力及迁移能力。4.在炎症性肠病相关性肠癌AOM+DSS动物模型实验中,早期肝素治疗组疾病活动程度和病理评分皆优于癌变对照组及晚期肝素治疗组,早期运用低分子肝素可以减少肿瘤个数,降低肠道炎症水平,抑制炎症性肠病相关性肠癌发生过程中EMT。