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红麻(Hibiscus cannabinus L.)是锦葵科木槿属一年生韧皮纤维经济作物,因其良好的纤维品质得到广泛应用。红麻具有极强的杂种优势,利用红麻细胞质雄性不育系(CMS)培育红麻杂交品种是杂种优势利用的主要途径,因此,揭示红麻CMS机理具有重要的理论意义和实际价值。 大量研究表明,花药发育小孢子时期的能量供应不足会导致CMS发生。目前,在对红麻CMS分子机制的研究中,有关能量代谢差异表达基因的研究主要集中于线粒体相关基因,然而,植物体的能量代谢是核与质相互协调的过程,因此研究不育系(P3A)和保持系(P3B)的核能量代谢差异表达基因对了解CMS植物体能量代谢的核与质相互协调机理是非常有益的探索过程。本课题组的前期工作通过DNA芯片技术和红麻花药转录组高通量测序技术证实,戊糖磷酸途径关键酶基因6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6-PGDH)和短链醇代谢的关键酶乙醇脱氢酶基因(Alcohol dehydrogenase,ADH1)在不育系和保持系中差异表达。为了更好的研究细胞质雄性不育与能量代谢差异基因之间的关联,本研究以红麻不育系(P3A)及相应保持系(P3B)为实验材料,提取了高质量红麻总DNA和总RNA,克隆了戊糖磷酸途径关键酶基因6-PGDH和短链醇代谢的关键酶乙醇脱氢酶基因(ADH1);同时对这两个基因进行了半定量RT-PCR分析;并构建6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶RNA干扰载体,主要结果如下: (1)成功的从红麻花药中提取了高质量的总DNA和总RNA。 (2)根据不育系(P3A)和保持系(P3B)花药转录组高通量测序结果,参考前期DNA微阵列差异分析结果,严格筛选相关差异基因序列片段,同时参考同源克隆所得片段,并提交NCBI,以Blast N,Blast P进行检索,再与其他物种的6-PDGH和ADH1基因序列进行同源性比对。在确认数据可信度的前提下,用生物信息学方法获得全长cDNA拼接序列,并分别以红麻不育系(P3A)和保持系(P3B)的花药cDNA以及总DNA为模板克隆了红麻6-PGDH基和ADH1基因全长。测序分析结果表明,红麻6-PGDH和ADH1基因扩增序列与其它植物的6-PGDH和ADH1基因保守序列具有很高的同源性,说明所扩增的片段是正确的基因片段。红麻6-PGDH基因在P3A(RNA)、P3B(RNA)、总DNA中PCR扩增产物的CDS区大小均为1458bp,编码485个氨基酸残基,无内含子。红麻ADH1基因在P3A(RNA)、P3B(RNA)中PCR扩增产物长度均为1300bp,在总DNA中PCR扩增产物长度为2256bp,PCR扩增产物的CDS区大小均为1071bp,编码356个氨基酸残基,包含8个外显子。 (3)半定量RT-PCR分析得出:红麻6-PGDH和ADH1基因在保持系(P3B)中的表达量明显大于不育系(P3A)。 (4)本研究以红麻6-PGDH基因为靶基因,构建特异沉默该基因的RNAi干扰载体。实验检测结果表明,以红麻6-PGDH基因为靶标的RNAi表达载体(pART27-pKANNIBAL-R1+2)构建成功,正向、反向干扰片段均为389bp。RNAi载体的构建为进一步研究红麻6-PGDH基因的功能奠定了基础,目前,利用花粉管通道法进行遗传转化的研究正在进行中。