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目的:1.建立生物检材（血液、尿液）中同时检测瑞芬太尼（Remifentanil）、舒芬太尼（Sufentanil）及其代谢物瑞芬太尼酸（Remifentanil Acid）和去甲舒芬太尼（Norsufentanil）的高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）检测方法。2.探究瑞芬太尼、舒芬太尼及其代谢物在生物检材（血液、尿液）中的稳定性,为瑞芬太尼、舒芬太尼相关案件的检材选取及保存提供实验基础,为涉及瑞芬太尼、舒芬太尼药物中毒案件的鉴定提供科学依据。方法:1.前处理与检测生物检材（血液、尿液）经柠檬酸酸化处理后,加入内标溶液,使用乙腈沉淀蛋白,复溶后经HPLC-MS/MS法检测,以定性离子对保留时间和相对丰度比定性,以标准曲线来进行定量（内标法）。2.血液中瑞芬太尼、舒芬太尼及其代谢物的稳定性研究采用L9（3~3）正交实验设计,研究时间、温度和抗凝剂3个因素对血液中瑞芬太尼、舒芬太尼及其代谢物稳定性的影响。根据正交实验表对瑞芬太尼、舒芬太尼及其代谢物采用HPLC-MS/MS法进行定性定量检测。（1）空白血液中添加瑞芬太尼、舒芬太尼及其代谢物的稳定性研究将空白尸体血平均分为5组,其中1组为空白对照,其余4组分别添加瑞芬太尼、瑞芬太尼酸、舒芬太尼和去甲舒芬太尼,每组3等份,分别保存于不同抗凝剂（EDTA、肝素钠、枸橼酸钠）采血管中,置于20℃、4℃、-20℃的储存条件下待检。（2）建立瑞芬太尼、舒芬太尼中毒动物模型,对其血液中瑞芬太尼、舒芬太尼及其代谢物的稳定性进行研究健康雄性巴马小型猪3只,其中1只为空白对照,其余2只分别以10倍最大治疗剂量,在耳缘静脉注射瑞芬太尼和舒芬太尼氯化钠水溶液,根据瑞芬太尼和舒芬太尼血液中的药物达峰时间将其处死,取心血保存于不同抗凝剂（EDTA、肝素钠、枸橼酸钠）采血管中,置于20℃、4℃、-20℃的储存条件下待检。3.空白尿液中添加瑞芬太尼、舒芬太尼及其代谢物的稳定性研究将空白尿液平均分为5组,其中1组为空白对照,其余4组分别添加瑞芬太尼、瑞芬太尼酸、舒芬太尼和去甲舒芬太尼,每组3等份,分别在20℃、4℃、-20℃的条件下储存,并于0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h、2d、3d、4d、5d、6d、7d、10d、15d、20d、25d、30d、35d提取检材,采用HPLC-MS/MS法定性定量检测瑞芬太尼、舒芬太尼及其代谢物。4.数据处理运用SPSSAU v21.0在线分析软件（https://spssau.com/indexs.html）及正交设计助手II v3.1对血液数据进行极差分析;运用IBM SPSS R26.0.0.0统计学软件对尿液数据进行方差分析。结果:1.生物检材中瑞芬太尼、舒芬太尼及其代谢物的检测经测定在血液和尿液中瑞芬太尼、瑞芬太尼酸、舒芬太尼和去甲舒芬太尼的线性范围为0.1～200ng/m L。在血液最低检出限分别为0.06ng/m L、0.2ng/m L、0.03ng/m L、0.02ng/m L;尿液最低检出限分别为0.02ng/m L、0.04ng/m L、0.01ng/m L、0.02ng/m L;相关系数（r）均大于0.995,日内和日间精密度均小于15%,提取回收率均大于80%,基质效应均在80%～120%范围内。2.生物检材中瑞芬太尼、舒芬太尼及其代谢物的稳定性研究（1）瑞芬太尼及其代谢物的稳定性研究血液组:空白血液添加瑞芬太尼结果显示瑞芬太尼的最佳保存条件为:-20℃、肝素钠。而其代谢物瑞芬太尼酸的浓度在27h内随时间不断升高,且在20℃、枸橼酸的保存条件下保持较高浓度;空白血液添加瑞芬太尼酸结果显示瑞芬太尼酸的最佳保存条件为:-20℃、枸橼酸钠。其原体瑞芬太尼的浓度在27h内先升高后下降,且在20℃、枸橼酸钠条件下有略高浓度;瑞芬太尼中毒动物血液结果显示,瑞芬太尼的最佳保存条件为:-20℃、EDTA;瑞芬太尼酸的最佳保存条件为:4℃、枸橼酸钠。尿液组:在不同温度条件下,瑞芬太尼和瑞芬太尼酸的含量均随时间迁移而下降。在瑞芬太尼添加组中检出代谢物,瑞芬太尼酸含量随时间迁移先上升后下降。在瑞芬太尼酸添加组中检出原体,瑞芬太尼含量随时间迁移先上升后下降。经方差分析显示,在-20℃、4℃、20℃保存条件下,瑞芬太尼和瑞芬太尼酸在空白尿液中随时间的含量变化差异均具有统计学意义（p＜0.01）。（2）舒芬太尼及其代谢物的稳定性研究血液组:空白血液添加舒芬太尼结果显示,在35天的保存过程中,舒芬太尼与最初浓度相比稳定在75%以上,其最佳保存条件为:-20℃、肝素钠;空白血液添加去甲舒芬太尼结果显示,在35天的保存过程中,去甲舒芬太尼与最初浓度相比稳定在80%以上,其最佳保存条件为:-20℃、肝素钠;舒芬太尼中毒动物血液结果显示,舒芬太尼的最佳保存条件为:-20℃、肝素钠;去甲舒芬太尼的最佳保存条件为:-20℃、枸橼酸钠。尿液组:在不同温度条件下,舒芬太尼及其代谢物含量均随时间迁移而下降。经方差分析显示:在-20℃保存条件下,舒芬太尼和去甲舒芬太尼在长期时间组中的含量变化均有统计学意义（p＜0.05）;在4℃和20℃保存条件下,中期和长期时间组中的含量变化具有统计学意义（舒芬太尼:p＜0.05;去甲舒芬太尼:p＜0.01）。结论:1.本实验建立了生物检材中（血液、尿液）瑞芬太尼、舒芬太尼及其代谢物的前处理方法和HPLC-MS/MS检测方法,样品前处理过程简单快速,方法准确率高、检测灵敏度高,达到了生物检材中毒物分析的要求和法医毒物动力学研究的要求,可用于瑞芬太尼和舒芬太尼的法医毒物动力学研究及其相关案件的法医学鉴定。2.保存血液和尿液中瑞芬太尼、瑞芬太尼酸、舒芬太尼和去甲舒芬太尼含量均随保存时间延长呈下降趋势,-20℃和枸橼酸钠采血管保存可阻止其分解,瑞芬太尼舒芬太尼相关案件法医学鉴定中应用采用枸橼酸钠采血管-20℃保存检材。3.瑞芬太尼和瑞芬太尼酸在保存血液和尿液中均可发生相互转化,代谢物瑞芬太尼酸更具稳定性,瑞芬太尼酸更适合作为瑞芬太尼相关案件鉴定的目标检测物;舒芬太尼和去甲舒芬太尼在保存尿液和血液中不会发生相互转化,两种物质均具有良好的稳定性,均适宜作为舒芬太尼相关案件鉴定的目标检测物,瑞芬太尼和舒芬太尼相关案件法医学鉴定时应同时检测瑞芬太尼、瑞芬太尼酸、舒芬太尼和去甲舒芬太尼。