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研究目的最新脓毒症(Sepsis)定义指出,脓毒症是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍。大脑在脓毒症的发展过程中起到至关重要的作用,不仅参与免疫调节,而且也是脓毒症病程进展中的受累器官。脓毒症相关性脑病(Sepsis-associated encephalopathy,SAE)是继发于脓毒症的弥漫性脑功能障碍及神经系统临床症状,患者通常不存在明显的中枢神经系统感染的情况。SAE临床表现差异较大,轻者出现谵妄,重者则出现昏迷等症状。SAE患者死亡率高,ICU50%死亡患者与SAE相关。SAE引起的远期认知功能改变是主要的神经损伤之一,对患者生活质量影响较大。既往研究发现胞外核苷酸、促炎性细胞因子、氧化应激反应可能是引起脓毒症相关性脑病病理变化的主要原因。消退素(Resolvins)是近几年研究较多的一种内源性促炎症消退脂质介质,由ω-3脂肪酸二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)代谢产生消退素D1(Resolvin D1,Rv D1)在多种动物模型中都体现出强大的促进炎症消退的作用,研究证实Rv D1能够提高脓毒症小鼠的生存率,减轻肺脏、肾脏等重要器官的炎性反应,起到保护和治疗的作用。由此推测消退素D1能够改善脓毒症相关性脑病小鼠的预后,从而为脓毒症相关性脑病患者的治疗提供新的方向。本课题拟通过脓毒症小鼠模型,研究Rv D1能否减少小胶质细胞活化,降低促炎性细胞因子水平,减轻神经系统炎症反应,最终改善小鼠行为学的表现,达到治疗甚至治愈脓毒症相关性脑病的目的。研究方法(一)小鼠脓毒症相关性脑病模型的建立1、将20只C57BL/6小鼠随机分成两组,对照组(Control组,n=10)、盲肠结扎穿孔手术组(CLP组,n=10)。建模前每只小鼠进行连续5天的水中运动训练。训练后次日CLP组行盲肠结扎穿孔术建立脓毒症模型。术后第2天开始,两组小鼠连续4天行隐蔽站台实验;术后第5天同时行空间探索实验。记录两组实验数据并统计分析相关指标。2、将12只C57BL/6小鼠随机分成两组,对照组(Control组,n=6)、盲肠结扎穿孔手术组(CLP组,n=6)。24h后收集各组小鼠脑组织,观察并比较两组小鼠海马组织IBA-1免疫组织化学染色并分析结果。(二)消退素D1对小鼠脓毒症相关性脑病的保护作用1、将24只C57BL/6小鼠随机分成四组,对照组(Control组,n=6)、盲肠结扎穿孔手术组(CLP组,n=6)、低剂量Rv D1处理组(CLP+Rv D1-L组,Rv D1 0.1μg/只,n=6)、高剂量Rv D1处理组(CLP+Rv D1-H组,Rv D1 1μg/只,n=6)。CLP造模后,即刻于小鼠尾静脉注射对应剂量Rv D1,CLP组只造模不给药,24h后收集各组小鼠外周血血浆。检测小鼠外周血促炎性细胞因子水平。2、将30只C57BL/6小鼠随机分成三组,对照组(Control组,n=10)、盲肠结扎穿孔手术组(CLP组,n=10)、Rv D1处理组(CLP+Rv D1组,n=10)。建模前每只小鼠进行连续5天的水迷宫训练。CLP+Rv D1组在术后即刻尾静脉注射Rv D11μg/只,CLP组不给药。术后第2天开始,连续4天行隐蔽站台实验;术后第5天同时行空间探索实验。记录各组MWM数据并统计分析相关指标。3、将18只C57BL/6小鼠随机分成三组,对照组(Control组,n=6)、盲肠结扎穿孔手术组(CLP组,n=6)、Rv D1处理组(CLP+Rv D1组,Rv D1 1ug/只,n=6)。CLP造模后,即刻于小鼠尾静脉注Rv D1 1μg/只,CLP组只造模不给药,24h后收集各组小鼠脑组织,观察并比较不同组小鼠海马组织IBA-1免疫组织化学染色并分析结果。(三)消退素D1对小鼠脓毒症相关性脑病治疗作用的可能机制探索1、将24只C57BL/6小鼠随机分成三组,对照组(Control组,n=8)、盲肠结扎穿孔手术组(CLP组,n=8)、Rv D1处理组(CLP+Rv D1组,Rv D1 1μg/只,n=8)。CLP造模后,即刻于小鼠尾静脉注Rv D1,CLP组只造模不给药,24h后收集各组小鼠外周血和海马组织,检测小鼠外周血促炎性细胞因子水平、海马组织匀浆做PCR检测相应m RNA水平并分析结果。2、利用BV2细胞建立小胶质细胞刺激模型,分为对照组(Control组),脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激组(LPS组),Rv D1处理组(LPS+Rv D1组,Rv D1 10n M每孔)。检测细胞上清促炎性细胞因子水平以及相应m RNA水平并分析结果。结果(一)小鼠脓毒症相关性脑病模型的建立1、在隐蔽站台实验中,从术后第2天开始CLP组潜伏期略有缩短,无统计学意义;Control组从术后第2天开始潜伏期逐渐缩短,术后第5天(30.11±4.12)最短,与术后第2天(50.46±9.31)相比有统计学意义(P<0.05);术后第5天潜伏期CLP组(47.42±9.23)较Control组(30.11±4.12)明显延长(P<0.05)。在空间探索实验中,穿台次数CLP组(0.65±0.40)较Control组(1.54±0.34)明显降低(P<0.05);目标象限时间CLP组(28.01±6.70)较Control组(41.12±6.22)延长(P<0.05)2085。2、小鼠海马组织IBA-1免疫组织化学染色结果,在×400倍数下观察,CLP组小胶质细胞活化数量明显较Control组多,小胶质细胞明显胞体较大,核深染,细胞膜增殖伸出较多的突触。(二)消退素D1对小鼠脓毒症相关性脑病的保护作用1、CLP小鼠模型中,CLP+Rv D1-L组和CLP+Rv D1-H组IL-6、IL-1β、TNFα水平均较CLP组降低(P<0.05)。且促炎性细胞因子,CLP+Rv D1-H组较CLP+Rv D1-L组水平低(P<0.05),与浓度梯度呈相关性。后续实验可选用较高剂量作为干预剂量。2、在隐蔽站台实验中,从术后第2天开始CLP组(51.36±9.02)与CLP+Rv D1组(51.78±9.17)和Control组(45.63±7.53)相比潜伏期延长(P<0.05);术后第3天,CLP+Rv D1组(40.83±6.37)较CLP组(43.25±5.37)潜伏期呈缩短趋势,与Control组(39.83±7.80)相比潜伏期仍延长;术后第4天开始,CLP+Rv D1组(32.57±19.86)较CLP组(45.75±5.48)潜伏期明显缩短(P<0.05),而与Control组(33.80±21.18)相比则无明显差异。3、在空间探索实验中,各组穿台率比较结果显示,CLP组(0.88±0.14)vs Control组(1.52±0.24)(P<0.05),CLP组(0.88±0.14)与CLP+Rv D1组(1.42±0.14)(P<0.05),Rv D1治疗组小鼠穿台率较CLP组升高;各组目标象限时间结果显示,CLP组(26.85±4.06)与CLP+Rv D1组(18.17±1.76)较Control组(18.45±0.90)目标象限时间延长,CLP组(26.85±4.06)vs CLP+Rv D1组(18.17±1.76)(P<0.05),Rv D1治疗组小鼠目标象限时间较CLP组明显延长。4、小鼠海马组织IBA-1免疫组织化学染色结果,在×200倍数下观察,CLP组活化小胶质细胞数量较Control组明显增加(P<0.05),同时CLP+Rv D1组较CLP组相比活化小胶质细胞数量明显减少(P<0.05),但CLP+Rv D1组小胶质细胞数相对多于Control组。CLP+Rv D1组较CLP组小胶质细胞激活状态表现不明显,细胞胞体较CLP组小,细胞突触较少。平均光密度结果提示,CLP+Rv D1组较CLP组平均光密度降低(P<0.05),但较Control组稍高。(三)消退素D1对小鼠脓毒症相关性脑病治疗作用的可能机制探索1、在在体实验中,CLP+Rv D1组外周血IL-6、IL-1β、TNFα水平较CLP组明显降低(P<0.05)。相对应的CLP+Rv D1组海马组织中IL-6、IL-1β、TNFαm RNA表达量较CLP组也明显减少(P<0.05),提示消退素D1对SAE的保护作用不仅与减轻全身炎症反应有关,同时还可能依赖于减轻脑内的炎症反应。2、在体外BV2细胞实验中,LPS+Rv D1组细胞上清IL-6、IL-1β、TNFα分泌量较LPS组明显降低(P<0.05)。相对应的LPS+Rv D1组BV2细胞中IL-6、IL-1β、TNFαm RNA表达量明显减低(P<0.05)。结论CLP术能够稳定的复制脓毒症相关性脑病小鼠模型。消退素D1能够从空间学习和空间记忆两方面改善SAE小鼠认知功能。可能与消退素D1减轻全身炎症反应的同时,减轻颅内小胶质细胞炎症反应水平有关。