尽管当前人们对固氮酶的结构和功能的认识已达到了原子水平，但对固氮酶活性中心FeMoco中催化底物N₂和H⁺的还原位点，及用于还原反应的质子和电子通道，至今仍未确定。 本论文中，通过定点突变及基因替代技术，成功构建了四个K. pneumoniae固氮酶突变体MoFe蛋白，其中：两个为单突变体，将野生型固氮酶钼铁蛋白α亚基中，铁钼辅因子（FeMoco）周围多肽链的Gln α 190和His α 194分别置换为Lys和Gln(α-Lys¹⁹⁰ Kp1和α-Gln¹⁹⁴ Kp1)；两个为双重置换的突变体，将上述两个氨基酸单独替换突变分别引入nifV突变株（nifV^-，与野生型FeMoco共价连接的高柠檬酸被置换为柠檬酸）而获得(α-Lys¹⁹⁰／NifV^- Kp1和α-Gln¹⁹⁴／NifV^- Ko1)。 在固氮条件下，所构建固氮酶突变菌株均表现为严格的Nif^-表型，不能进行固氮生长。大量培养各突变株并充分诱导细胞固氮酶的表达，利用相同的柱层析和制备电泳程序纯化了四个突变体固氮酶以及来自野生型和nifV突变株的MoFe蛋白及野生型Fe蛋白。对比分析了四个突变体固氮酶、野生型和NifV^-固氮酶的MoFe蛋白催化N₂、H⁺及C₂H₂还原的酶学特性，及部分突变体固氮酶MoFe蛋白放H₂和C₂H₂还原受CO抑制的酶动力学，并推测出N₂和H⁺还原的位点。 四个突变体固氮酶、野生型和NifV^-固氮酶的MoFe蛋白的底物还原特性比较表明：（1）α-Gln¹⁹⁴替换不影响固氮酶还原质子时的总电子流；尤其引人注意的是，含有α-Lys¹⁹⁰和柠檬酸双重替换的MoFe蛋白几乎完全失去了质子还原的能力。（2）α-Gln¹⁹⁴替换与其它两个替换相比，对固氮酶N₂还原的影响更为直接。（3）α-Gln¹⁹⁴替换使得固氮酶还原C₂H₂时，电子流分配偏向于放氢，而α-Lys¹⁹⁰替换则完全阻断了固氮酶还原C₂H₂的电子流。CO对NifV^-MoFe蛋白放氢的最大抑制率为71％，α-Gln¹⁹⁴和柠檬酸双重替换使的CO抑制固氮酶放氢的最大抑制率下降到31％。（5）CO与含有α-Lys¹⁹⁰替换的MoFe蛋白的亲和力比对含有α-Gln¹⁹⁴和citrate双重替代的MoFe蛋白及NifV^-蛋白的亲和力要低。 对四个突变株细胞的C₂D₂还原特性及还原产物中反式-／顺式-1，2-二氘代乙炔的比例进行了测定并与野生型及nifV突变株相比较，结果表明只有α-Gln¹⁹⁴替换不影响C₂D₂还原产物中反式-／顺式-1，2-二氘代乙炔的比例，即未改变固氮酶还原C₂H₂加氢的立体构型的专一性。 各突变体固氮酶底物还原及酶动力学特性的变化暗示：（1）α-Lys¹⁹⁰位点及其与高柠檬酸的协同作用，在质子和电子向FeMoco传递中起重要作用，而α-Gln¹⁹⁴和高柠檬酸位点的改变对固氮酶放氢的影响却相对独立。（2）α-Gln¹⁹⁴位点在N₂还原中有其特有的功能，并体现出在H⁺和N₂，或H⁺和C₂H₂还原时调节电子分配的角色。（3）α-Lys¹⁹⁰位点和高柠檬酸位点可能通过一种共有的机制影响固氮酶FeMoco上一个放氢位点。 根据本论文的研究结果，我们推测固氮酶络合和还原N₂和H⁺的位点：（1）固氮酶FeMoco中央的Fe原子区为N₂络合和还原的位点，所消耗的质子和电子由临近的α-His¹⁹⁴通过与FeMoco的一个S原子（S2B）之间形成的氢键进入，其反应式为：N₂+8H⁺+8e^-→2NH₃+HZ，此反应受CO抑制;（2）几Moco的Mb原子为专一的放氢位点，所用的质子和电子由与M。结合的高柠橡酸传入，其反应式为:ZH++2e’，HZ，此反应不受co抑制;。心Inl90一高柠稼酸一M。是一条通向FeMoco的重要的电子传递途径。 同时进一步验证了本实验室以前提出的固氮酶在生理条件下具有双位点放氢的模式，并明确固氮酶双位点放氢模式为:放氢位点I:为依赖NZ的放氢位点，定位于FeMOCo的中间六铁区，同时是NZ、CZHZ和CO的络合位点:放氢位点H:为不依赖NZ的放氢位点，定位于FeMoco的Mo原子上。放氢位点11即M。位是FeMoc。中接受电子和质子的首要位点。 本论文中所构建的含价Lysl90和citrate，以及。心Inl侧和ci姗双重替换的突变体固氮酶在进一步固氮酶机制的研究中将会非常有用。