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树木的维管形成层在多年生植物中表现出周期性。维管形成层的生长发育过程与大量基因的调控相关,其中miRNAs(microRNAs)对维管形成层活动周期的调控机理在近年来受到研究人员的广泛关注。识别并鉴定泡桐维管形成层活动周期转换相关的miRNA能更好的理解维管形成层发育的分子机制。本实验构建维管形成层休眠期、萌动期和活跃期3个小分子RNA(sRNA)文库并进行Solexa测序,通过生物信息学的方法对sRNA进行分离和鉴定来识别维管形成层活动周期相关的miRNAs,并且利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了部分miRNA及其靶基因在泡桐维管形成层的休眠期(DC)、萌动期(RC)、活跃期(AC)的表达水平。具体实验结果如下:1.通过对泡桐维管形成层休眠期(DC)、萌动期(RC)、活跃期(AC)三个时期进行Solexa测序,分别在三个样品中得到7722583、7938631、7972651条raw reads序列,去除低质量序列、接头污染、N的比例大于10%的序列、polyA/T/G/C序列,得到7529295、7803216、7821819条clean reads。2.以泡桐转录组为参考序列,共鉴定49个已知miRNA家族(miRNA家族的丰度差异很大,而且相同miRNA家族不同成员的表达水平也显着不同)和33个新的miRNA。3.根据|log?fold change?|≥1且P≤0.05两个标准比较AC vs DC、AC vs RC以及RC vs DC之间的miRNA的表达水平,共发现360个差异表达miRNAs。其中,在AC与DC的比较中,发现107个差异表达miRNAs;在AC与RC的比较中,发现132个差异表达miRNAs;在RC与DC的比较中,发现121个差异表达miRNAs。4.使用psRNATarget网络服务器预测已知miRNA家族和新miRNA的靶基因,共预测到528个靶基因。其中,49个已知miRNA家族中有26个家族可以预测到456个靶基因,33个新的miRNA中有25个可以预测到71个靶基因。5.对靶基因进行GO功能分析,在生物学过程这一功能分类中,生物学过程、代谢过程和细胞过程功能组得到的注释最多;在细胞组分这一功能分类中,细胞组分、细胞和细胞部分功能组的注释数目最多;在分子功能这一分类中,结合、催化活性和杂环化合物结合得到的注释最多。对差异表达miRNA的靶基因进行KEGG分析,这些靶基因被分类为20种不同的途径,淀粉和蔗糖代谢、RNA降解、植物-病原体相互作用等途径等到显著富集。说明miRNA在植物的生长发育和代谢过程中起着重要的调控作用。6.对具有已知前体序列的6种已知的miRNA(pto-miR156b、pto-miR164a、pto-miR171d、pto-miR172c、pto-miR319d、pto-miR399a)和3种新miRNA(pto-miR02、pto-miR16和pto-miR21)在维管形成层的休眠期(DC)、萌动期(RC)、活跃期进行实时荧光定量PCR分析,结果显示通过qRT-PCR测定的这些miRNA前体的表达水平与来自高通量测序的那些成熟miRNA的表达水平有相似的表达趋势。7.对挑选出来的9个miRNA靶基因进行qRT-PCR实验验证发现,pto-miR160a和pto-miR21的表达与其潜在的靶基因的表达没有显示出良好的相关性。然而,其他7种miRNA(pto-miR156b、pto-miR171d、pto-miR172c、pto-miR319d、pto-miR398b、pto-miR02和pto-miR16)的表达与它们潜在靶基因(SPL、SCL转录因子、APETALA2、Laccase-14-like、Cu-Zn SOD、NBS抗性蛋白和受体蛋白激酶)的表达存在负相关关系,表明这些miRNA可能参与了泡桐维管形成层周期转换的调控。