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目的:通过建立大鼠椎间盘突出重吸收实验动物模型,观察重吸收过程中,突出椎间盘组织质量变化、形态结构,观察并检测突出椎间盘组织中新生血管、炎性细胞、基质金属蛋白酶等表达的变化,探讨椎间盘突出后重吸收发生的机制,进一步探讨中药益气逐瘀利水方促进椎间盘突出后重吸收,尤其是破裂型突出重吸收的机理。
方法:选择三月龄SPF级SD雄性大鼠126只,采用计算机随机数字法将其分为6组:模型组Ⅰ(椎间盘不刺破组,模拟未破裂型突出)、模型组Ⅱ(椎间盘刺破组,模拟破裂型突出)、TNF-α抑制剂组、硫唑嘌呤组、益气逐瘀利水方组、假手术组。每组7只。动物造模,经手术取出大鼠尾部完整的第3椎间盘组织,用万分之一单位的电子天平测量质量,确定初始质量后将椎间盘放入有孔的200μL的Ep管中,并埋植在其腰背部硬膜外。分别在用药10d、20d、30d后取出埋植的椎间盘组织,测量药物干预前后的质量变化,并运用组织病理学、免疫组化、流式细胞仪、透射电镜、实时荧光定量PCR仪等方法,观察并检测用药前后突出椎间盘组织形态学、细胞超微结构、炎症因子、免疫因子、新生血管、胶原、蛋白基因等指标的变化。
结果:(1)药物干预后,用药组椎间盘组织质量明显减轻,P<0.05,有统计学意义;各组椎间盘形态学发生了明显改变。
(2)透射电镜观察:模型组椎间盘细胞,细胞表面突起减少,细胞器稀少,胞质内有脂滴,核膜不光滑,大量纤维错乱排列,个别还可以见到凋亡细胞形成的凋亡小体。中药益气逐瘀利水方组细胞器丰富,细胞质中可见排列整齐的粗面内质网和线粒体、溶酶体、个别组细胞代谢活跃,细胞肥大,细胞器增多,线粒体增粗。
(3)模型组Ⅱ(椎间盘刺破组,模拟破裂型突出)和益气化瘀方组新生血管(VEGF、CD31),炎性细胞(CD19、IL-2、TNF-α)和基质金属蛋白酶(MMP3)的阳性表达都高于其他各组,提示炎性细胞、新生血管、基质金属蛋白酶等表达高的破裂型突出更容易重吸收,中药益气逐瘀利水方可以促进破裂型突出的重吸收。
(4)破裂型突出中,T细胞和巨噬细胞表达量较高,而中药益气逐瘀利水方可以显著提高突出组织中T细胞和巨噬细胞的数量。
(5)在各个时间点的各组椎间盘髓核中均检测到IL-2、TNF-α、VEGF、Col2α1、MMP3、MMP13mRNA表达,随着时间的推移,表达量逐渐增多。其中,模型组Ⅱ和中药益气逐瘀利水方组待测基因mRNA表达量最多。
结论:(1)透射电镜观察,破裂型突出细胞器丰富,容易发生重吸收,而未破裂型突出难以重吸收。中药益气逐瘀利水方组椎间盘基质胶原纤维密集增生,细胞代谢活跃,因而更易发生重吸收。
(2)椎间盘突出重吸收中,炎性细胞的吞噬作用、新生血管的形成、突出物接触血运后引发的自身免疫反应、组织降解酶、以及胶原均有重要的作用。
(3)在椎间盘突出重吸收过程中,自身免疫反应起着重要的作用,突出椎间盘组织中,尤其是破裂型突出,可以检测到T细胞和巨噬细胞表达,引起自身免疫反应,促进其重吸收。益气逐瘀利水方够对通过提高突出组织中T细胞和巨噬细胞的数量能自身免疫反应起一定的增强作用,从而促进突出组织的重吸收。