肠易激综合征(irritablebowelsyndrome，IBS)是临床上常见的功能性胃肠病，其主要临床表现之一是腹痛和腹部不适，属于一种慢性内脏痛敏。目前西医治疗IBS多限于对症治疗，疗效巩固可靠者甚少。课题组临床研究发现艾灸效穴(天枢、上巨虚穴)有效缓解IBS患者腹痛。围绕“艾灸缓解IBS样慢性内脏痛敏的机制研究”，我们前期已开展了部分实验，发现，在外周，温和灸天枢、上巨虚穴能调节结肠黏膜异常升高的5-HT、prokineticin-1、prokineticinreceptor-1，发挥缓解内脏痛敏的镇痛作用；在中枢，温和灸能激活脊髓水平强啡肽-Kappa受体系统、抑制下丘脑异常升高的促肾上腺皮质激素释放因子(Corticotropin-releasingfactor，CRF)，发挥镇痛效应。因此，有必要在此基础上进一步开展IBS样慢性内脏痛敏的机制研究及温和灸对其的调节机制研究，揭示艾灸缓解慢性内脏痛敏的科学基础，为临床提供实验和理论依据。　　已证实，孤啡肽(Orphanin-FQ，OFQ)与强啡肽在结构与部分功能上相似，孤啡肽-ORL1受体系统激活，可在脊髓水平发挥镇痛作用。CRF是应激反应的起始调节因子，在应答应激、痛觉调制中起着关键性作用。CRF主要通过CRFR1、CRFR2两种信号途径发挥不同的生物学效应。鉴于IBS慢性内脏痛敏的形成和发展与脊髓有着密切的关系，本论文在前期工作的基础上，进一步研究脊髓水平阿片肽系统(孤啡肽-ORL1受体系统)、CRF及其受体信号途径在IBS样慢性内脏痛敏中的作用及温和灸对其的调节机制，并探讨脊髓孤啡肽、CRF及其受体信号途径在慢性内脏痛敏中的作用关系。　　目的：　　方法：　　研究分为4个部分：　　1.分3个实验：观察鞘内注射孤啡肽或/和ORL1受体特异性拮抗剂([Nphel]nociceptin(1-13)NH2)对慢性内脏痛敏大鼠痛阈的影响；观察鞘内注射孤啡肽或/和ORL1受体特异性拮抗剂对温和灸缓解痛敏效应的影响；观察孤啡肽及ORL1受体在痛敏大鼠脊髓背角的表达及温和灸对其的影响。　　实验一：随机将大鼠分为正常组、模型组、i.t.OFQ组、i.t.NS组、i.t.[Nphel]nociceptin(1-13)NH2组、i.t.OFQ+[Nphel]nociceptin(1-13)NH2组。i.t.OFQ组、i.t.NS组、i.t.[Nphel]nociceptin(1-13)NH2、i.t.OFQ+[Nphel]nociceptin(1-13)NH2组，于大鼠出生后第36天分别给予鞘内注射OFQ、NS、[Nphel]nociceptin(1-13)NH2、OFQ+[Nphel]nociceptin(1-13)NH2。采用AWR评分，观察鞘内注射孤啡肽或/和ORL1受体拮抗剂对慢性内脏痛敏大鼠痛阈的影响。　　实验二：随机将大鼠分为正常组、模型组、温和灸组、温和灸+i.t.[Nphel]nociceptin(1-13)NH2组、温和灸+i.t.OFQ组。温和灸+i.t.[Nphel]nociceptin(1-13)NH2组、温和灸+i.t.OFQ组大鼠在每次温和灸干预前15分钟分别给予鞘内注射[Nphel]nociceptin(1-13)NH2、OFQ，每天1次，共7天；i.t.[Nphel]nociceptin(1-13)NH2、i.t.OFQ组大鼠每天同一时间分别给予鞘内注射[Nphel]nociceptin(1-13)NH2、OFQ，每天1次，共7天。采用AWR评分，观察鞘内注射孤啡肽或/和ORL1受体拮抗剂对温和灸缓解痛敏效应的影响。　　实验三：随机将大鼠分为正常组、模型组、温和灸组、假灸组，采用原位杂交的方法观察L6-S1脊髓节段OFQmRNA、ORL1mRNA的表达；免疫组化的方法观察相应脊髓节段OFQ的表达；酶联免疫检测法(Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)检测相应脊髓节段OFQ的浓度，旨在寻找脊髓水平孤啡肽及ORL1受体参与慢性内脏痛敏及温和灸缓解痛敏作用的形态学依据。　　2.观察鞘内注射孤啡肽或/和温和灸干预对脊髓背角SP、Glu表达的影响。随机将大鼠分为正常组、模型组、温和灸组、i.t.OFQ组、温和灸+i.t.OFQ组。采用免疫组化法，观察L6-S1脊髓节段Glu、SP的表达及温和灸干预或/和鞘内注射孤啡肽对其的影响。旨在探讨孤啡肽及温和灸干预时脊髓水平兴奋性神经递质的影响。　　3.分2个实验：观察CRF、CRFR1、CRFR2在慢性内脏痛敏大鼠结肠的表达及温和灸对其的影响；观察CRF、CRFR1、CRFR2在慢性内脏痛敏大鼠脊髓背角的表达及温和灸对其的影响。　　实验一：随机将大鼠分为正常组、模型组、温和灸组、假灸组，采用免疫组化的方法观察各组大鼠结肠CRF、CRFR1、CRFR2的表达；荧光定量PCR法检测CRFmRNA、CRFR1mRNA、CRFR2mRNA的相对表达。　　实验二：随机将大鼠分为正常组、模型组、温和灸组、假灸组，采用免疫组化的方法观察各组大鼠脊髓背角CRF、CRFR1、CRFR2的表达；荧光定量PCR法检测CRFmRNA、CRFR1mRNA、CRFR2mRNA的相对表达。　　4.观察i.t.CRFR1拮抗剂、i.t.CRFR2拮抗剂对慢性内脏痛敏大鼠痛阈及相应脊髓节段孤啡肽的影响。初步探讨脊髓水平孤啡肽与CRF-CRFR1信号途径、CRF-CRFR2信号途径在IBS样慢性内脏痛大鼠模型中的关系。随机将大鼠分为正常组、模型组、i.t.CRFR1拮抗剂组、i.t.CRFR2拮抗剂组、i，t.NS组。造模成功后，i.t。CRFR1拮抗剂组、i.t.CRFR2拮抗剂组、i.t.NS组，于大鼠出生后第36天分别给予鞘内注射CRFR1拮抗剂、CRFR2拮抗剂、NS。采用AWR评分作为检测内脏痛敏的行为学指标；ELISA法检测各组大鼠脊髓相应节段孤啡肽含量。　　结果：　　1.脊髓水平孤啡肽-ORL1受体系统在慢性内脏痛敏及温和灸对其疗效中的作用　　1.1鞘内注射孤啡肽或/和ORL1受体拮抗剂对慢性内脏痛敏大鼠痛阈的影响随着刺激强度的增加(20、40、60、80mmHg)，各组大鼠AWR评分上升。在不同强度的CRD刺激下，与正常组AWR评分相比，模型组升高(P<0.01)：与模型组相比，i.t.NS组、i.t.[Nphel]nociceptin(1-13)NH2组大鼠AWR评分无明显变化，i.t.OFQ组大鼠AWR评分降低(P<0.01，P<0.05)；与i.t.OFQ组比，i.t，OFQ+[Nphel]nociceptin(1-13)NH2组大鼠AWR评分升高(P<0.01，P<0.05)。　　1.2鞘内注射孤啡肽或/和ORL1受体拮抗剂对温和灸缓解痛敏效应的影响　　在不同强度(20、40、60、80mmHg)的CRD诱发刺激下，与正常组AWR评分相比，模型组增加(P<0.01)；温和灸干预后，大鼠AWR评分降低(P<0.01)，但仍高于正常组(P<0.01，P<0.05)；与温和灸组相比，温和灸+i.t.[Nphel]nociceptin(1-13)NH2组大鼠AWR评分升高(P<0.01，P<0.05)。与温和灸组相比，温和灸+i.t.OFQ组大鼠AWR评分降低(P<0.05)。　　1.3孤啡肽及ORL1mRNA在内脏痛敏大鼠脊髓背角的表达及温和灸对其的影响　　1.3.1各组大鼠降结肠局部组织HE染色观察　　肉眼观察，各组大鼠结肠局部光滑，与周围组织无粘连，未见明显病理改变；HE镜检结果显示，各组大鼠肠壁分层清楚，结肠黏膜结构完好，未见明显组织缺损，腺体排列整齐，间质无明显充血、水肿、炎细胞浸润等，黏膜下层未见明显异常改变。　　1.3.2大鼠慢性内脏痛的行为学评分结果　　各组大鼠对不同强度(20、40、60、80mmHg)的CRD刺激敏感性不同，随着刺激强度的增加，各组大鼠AWR评分增加。与正常组大鼠相比，模型组AWR评分上升(P<0.01)。与模型组大鼠相比，温和灸组AWR评分下降(P<0.01)；假灸组大鼠AWR评分无统计学变化。　　1.3.3ppOFQmRNA在内脏痛敏大鼠脊髓背角的表达及温和灸对其的影响　　与正常组相比，模型组大鼠脊髓背角ppOFQmRNA阳性目标总面积与OD值均升高(P<0.01)。温和灸干预后，大鼠脊髓背角ppOFQmRNA阳性目标总面积与OD值均进一步升高(P<0.01)。假灸组大鼠与模型组相比，差异无统计学意义。　　1.3.4OFQ在内脏痛敏大鼠脊髓背角的表达及温和灸对其的影响　　与正常组相比，模型组大鼠脊髓背角OFQ阳性目标总面积与OD值升高(P<0.01)。温和灸干预后，大鼠脊髓背角OFQ阳性目标总面积与OD值升高，但仅OD值具有统计学意义(P<0.05)。假灸组与模型组相比，无统计学差异。　　1.3.5温和灸对慢性内脏痛敏大鼠相应脊髓节段OFQ含量的影响　　与正常组相比，模型组大鼠脊髓OFQ含量升高(P<0.05)。温和灸干预后，大鼠相应脊髓节段OFQ含量进一步升高(P<0.05)。假灸组与模型组比较，无统计学差异。　　1.3.6ORL1mRNA在IBS慢性内脏痛敏大鼠脊髓背角的表达及温和灸对其的影响　　与正常组大鼠相比，模型组ORL1mRNA阳性目标总面积与OD值升高(P<0.01)。温和灸干预后，ORL1mRNA阳性目标总面积与OD值进一步升高(P<0.01)。假灸组与模型组相比，差异无统计学意义。　　2.鞘内注射孤啡肽或/和温和灸干预对慢性内脏痛敏大鼠脊髓SP、Glu表达的影响　　2.1各组大鼠AWR评分比较　　结果显示：随着刺激强度的增加，各组大鼠AWR评分上升。在不同强度的CRD刺激下，与正常组相比，模型大鼠AWR评分升高(P<0.01)。与模型组相比，i.t.OFQ组、温和灸组大鼠AWR评分下降(P<0.01，P<0.05)；假灸组与模型组AWR评分相比，差异无统计学意义。与i.t.OFQ组、温和灸组相比，温和灸+i.t.OFQ组大鼠在40、60、80mmHg强度的CRD刺激下，AWR评分降低，但仅80mmHg强度下有统计学意义(P<0.05)。　　2.2.各组大鼠脊髓背角Glu表达的比较　　与正常组比较，模型组升高(P<0.01)；与模型组比较，i.t.OFQ组、温和灸组、温和灸+i.t.OFQ组表达降低(P<0.01)；与i.t.OFQ组相比，温和灸+i.t.OFQ组表达降低(P<0.01)；与温和灸组相比，温和灸+i.t.OFQ组表达降低(P<0.05)。　　2.3各组大鼠脊髓背角SP表达的比较　　与正常组比较，模型组表达升高(P<0.01)；与模型组相比，i.t.OFQ组表达降低(P<0.05)，温和灸组表达降低(P<0.05)，温和灸+i.t.OFQ组降低(P<0.01)。　　3.温和灸对IBS样慢性内脏痛敏大鼠CRF及其受体调节作用的研究　　3.1温和灸对IBS样慢性内脏痛敏大鼠结肠CRF及其受体调节作用的研究　　3.1.1各组大鼠AWR评分比较　　在不同强度的CRD刺激下，与正常组相比，模型大鼠AWR评分升高(P<0.01)。温和灸组干预后，大鼠AWR评分下降(P<0.01)。　　3.1.2CRF、CRFR1、CRFR2蛋白及基因在痛敏大鼠结肠的表达及温和灸对其的影响　　组间比较显示：模型组大鼠CRF表达高于正常组(P<0.01)，温和灸干预后，CRF表达降低(P<0.01)，但仍高于正常组(P<0.05)。假灸组与模型组比较，差异无统计学意义。模型组大鼠CRFR1表达高于正常组(P<0.01)，温和灸干预后，CRFR1表达降低(P<0.01)，但仍高于正常组(P<0.01)。假灸组与模型组比较，差异无统计学意义。模型组大鼠CRFR2表达高于正常组(P<0.01)。与模型组比较，温和灸组大鼠CRFR2表达进一步增加(P<0.01)。假灸组与模型组比较，差异无统计学意义。　　组间比较显示：模型组大鼠CRFmRNA、CRFR1mRNA、CRFR2mRNA表达均高于正常组(P<0.01，P<0.05)。温和灸干预后，CRFmRNA、CRFR1mRNA表达降低(P<0.01)；CRFR2mRNA表达增加(P<0.05)。假灸组与模型组比较，差异无统计学意义。　　3.2温和灸对IBS样慢性内脏痛敏大鼠脊髓背角CRF及其受体调节作用的研究　　3.2.1各组大鼠AWR评分比较　　与正常组相比，模型大鼠AWR评分升高(P<0.01)。温和灸组干预后，大鼠AWR评分下降(P<0.01，P<0.05)。假灸组与模型组相比，差异无统计学意义。　　3.2.2CRF、CRFR1、CRFR2蛋白及基因在痛敏大鼠脊髓背角的表达及温和灸对其的影响　　组间比较显示：模型组大鼠CRF表达高于正常组(P<0.01)；与模型组比较，温和灸组大鼠CRF表达降低(P<0.01)。假灸组与模型组相比，差异无统计学意义。模型组大鼠CRFR1表达高于正常组(P<0.01)；与模型组比较，温和灸组大鼠CRFR1表达降低(P<0.01)。假灸组与模型组相比，差异无统计学意义。模型组大鼠CRFR2表达高于正常组(P<0.01)；与模型组比较，温和灸组大鼠CRFR2表达进一步升高(P<0.01)。假灸组与模型组相比，差异无统计学意义。　　组间比较显示：模型组大鼠CRFmRNA、CRFR1mRNA、CRFR2mRNA表达均高于正常组(P<0.01，P<0.05)。温和灸干预后，CRFmRNA、CRFR1mRNA表达降低(P<0.01)；CRFR2mRNA表达增加(P<0.02)。假灸组与模型组比较，差异无统计学意义。　　4、IBS样慢性内脏痛敏大鼠脊髓背角孤啡肽与CRF及其受体信号系统的关系　　4.1各组大鼠AWR评分比较　　各组大鼠对不同强度(20、40、60、80mmHg)的CRD刺激敏感性不同，随着刺激强度的增加，各组大鼠AWR评分增加。在不同强度的CRD刺激下，与正常组大鼠相比，模型组AWR评分上升(P<0.01)。与模型组大鼠相比，i.t.CRFR1拮抗剂组大鼠AWR评分下降(P<0.01)。与模型组大鼠相比，i.t.CRFR2拮抗剂组大鼠AWR评分升高，但差异无统计学意义。与模型组大鼠比较，i.t.NS组大鼠AWR评分差异无统计学意义。　　4.2各组大鼠脊髓相应节段孤啡肽含量的比较　　组间比较显示，模型组大鼠孤啡肽含量高于正常组(P<0.01)；与模型组比较，i.t.CRFR1拮抗剂组大鼠孤啡肽含量升高(P<0.05)；i.t.CRFR2拮抗剂组大鼠孤啡肽含量降低(P<0.05)；i.t.NS组大鼠孤啡肽含量无明显改变。　　结论：　　1.在IBS样慢性内脏痛敏大鼠模型，鞘内注射一定剂量的OFQ可通过ORL1受体产生缓解痛敏的镇痛作用；温和灸缓解慢性内脏痛敏的作用能被鞘内注射ORL1受体特异性拮抗剂部分阻断，且能被鞘内注射OFQ加强，提示脊髓水平OFQ-ORL1受体系统参与了温和灸缓解IBS样慢性内脏痛敏的过程。　　2.在IBS样慢性内脏痛敏大鼠模型，L6-S1脊髓节段OFQ、ORL1mRNA表达升高，提示慢性内脏痛敏激活脊髓水平OFQ-ORL1受体系统；温和灸天枢、上巨虚穴进一步促进OFQ、ORL1受体的表达，提示温和灸干预能通过激活脊髓水平OFQ-ORL1受体系统发挥缓解IBS样慢性内脏痛敏的作用。　　3.鞘内注射孤啡肽及温和灸干预都能降低慢性内脏痛敏大鼠脊髓背角SP、Glu的表达。提示：温和灸缓解慢性内脏痛敏的脊髓水平机制之一是与其减少SP、Glu的表达有关；脊髓水平OFQ-ORL1受体系统缓解慢性内脏痛敏的脊髓水平机制之一与其减少SP、Glu的表达有关。　　4.温和灸干预降低IBS大鼠内脏痛敏与其抑制外周(结肠)与脊髓中枢CRF-CRFR1信号系统，激活CRF-CRFR2信号系统有关。　　5.在IBS样慢性内脏痛敏大鼠模型，脊髓水平CRF-CRFR1信号途径激活，参与内脏痛敏的发生和维持；CRF-CRFR2信号途径激活，抑制内脏痛敏。促进OFQ表达是CRF-CRFR2信号途径发挥缓解痛敏的机制之一。