脑疾病是中国和世界人口健康面临的主要挑战。在过去的20年中,脑部疾病的发病率显著增加,给当今社会带来了沉重的负担。因此,脑作为人体最复杂的系统,能够有效诊断重大脑疾病的新方法新技术已成为国内外共同关注的前沿研究热点。虽然先进成像技术的发展已经显著提高了大脑病变的诊断率,但在早期病变和神经退行性病变中的病变特征仍不清楚,其成像分辨率一般只有毫米量级,无法作为临床最终诊断结果。而且,明确诊断必须采用染色或者特异性的免疫组化等步骤。因此,在无标记的情况下,能够在脑疾病中提供具有组织病理学高分辨率、快速病理诊断的医学影像技术,将为术中和术后的临床病理学诊断研究提供重要支撑,并成为临床医学的迫切需求。多光子显微技术(Multiphoton microscopy,MPM)是基于激光和生物组织相互作用的先进医学成像技术。不需要额外的分子探针便可以在生物组织的许多内源性成分中激发出较强的双光子激发荧光和二次谐波产生信号。具有低损伤、高灵敏度、高空间分辨率等独特优势,已经广泛应用于生命科学的各个领域。因此,本文基于MPM开展并拓宽其在脑疾病中的应用,对正常脑结构、脑肿瘤、缺血性脑卒中、大脑局灶性皮质发育不良和阿尔茨海默病进行了重点研究,主要内容归纳如下:(1)在正常脑结构的研究方面,本文分析了脑中皮质、海马、以及不同细胞的多光子显微成像特征,确定脑组织中的内源性信号来源。初步验证MPM在脑成像应用方面的可行性。(2)在脑肿瘤的研究方面,将MPM与可编程的图像处理相结合,识别了肿瘤核心和肿瘤周边区域,提出对小脑肿瘤病理快速可视化的潜在新方法。(3)在缺血性脑卒中的研究方面,MPM确定了脑缺血不同时间点皮质和纹状体的形态结构变化,并对脑梗死病理的时空进展进行无标记评估。(4)在癫痫的研究方面,结合深度学习的方法,对大脑局灶性皮质发育不良的区域进行辅助识别。(5)在阿尔茨海默病的研究方面,首次揭示细胞外Aβ斑块和细胞内Aβ的聚集,并结合可编程的图像处理程序,对不同程度的Aβ沉积进行区分和可视化。以上研究结果验证了MPM在脑成像应用方面的可行性,为脑疾病的研究提供了新方法,也为MPM未来在快速病理诊断和临床应用方面提供了有力依据。