精子发生是一个精密调控的生物学进程。它主要包括精原干细胞（Spermatogonial Stem Cells,SSCs）的自我更新与分化、精母细胞（Spermatocytes）的减数分裂以及精子变形（Spermiogenesis）。近年来,蛋白质翻译后修饰（如,磷酸化、乙酰化、糖基化和泛素化）在精子发生过程的重要作用已经越来越多的被报道,贯穿了整个精子发生周期。泛素化（Ubiquitination）是一个由泛素化酶和去泛素化酶共同介导的可逆性的生物学反应。泛素分子（Ubiquitin,Ub）在E3连接酶的作用下可以连接于底物蛋白的氨基酸残基,而在去泛素化酶的作用下可以将泛素化链移除。近年来,许多泛素化酶在精子发生中的作用已逐渐被阐明,而对于去泛素化酶在其中的功能却知之甚少。为了更好的研究去泛素化酶在精子发生过程中的功能,在本研究中,我们首先对现有报道的所有去泛素化酶进行生物信息学分析与筛选,最终关注到一个作为候选的“雄性生育必须”（Male fertility essential）蛋白--USP42。USP42是一个睾丸优势表达的去泛素化酶,在以往的体外实验及细胞系实验的研究中,USP42被认为是可以去泛素化P53及组蛋白H2B,而其在睾丸中的功能尚无报道。通过对Usp42基因敲除小鼠的研究,我们发现雄性Usp42敲除小鼠完全不育而雌性生育完全正常。形态学观察发现Usp42敲除睾丸精子发生阻滞,表现为睾丸特异细胞连接——胞质外特化连接（Ectoplasmic Specialization,ES）的紊乱,精子头部变形障碍,精子排放障碍和最终的细胞凋亡。而Usp42敲除睾丸内的其它细胞组分（如,精原干细胞、精母细胞、支持细胞、血管内皮细胞及间质细胞等）无明显异常。同时,由于ES连接是由支持细胞（Sertoli cells）和生殖细胞（Germ cells）共同组成,我们分别构建了 Usp42生殖细胞特异性敲除小鼠（g-KO）和支持细胞特异性敲除小鼠（s-KO）,结果发现g-KO睾丸的表型与全敲睾丸类似,而s-KO无明显表型,提示Usp42在生殖细胞中发挥了不可代替的作用。为了阐明Usp42调控精子发生的分子机制,我们通过CRISPR/Cas9技术构建了Usp42-flag小鼠。睾丸内免疫共沉淀实验（co-IP）发现USP42可以与ES连接相关蛋白RAI14相互作用。RAI14在敲除睾丸中蛋白水平明显降低而其mRNA水平不变,并且RAI14的泛素化水平在敲除睾丸中明显增加,以上提示USP42作为去泛素化酶可以通过结合底物RAI14而去掉其泛素化链,进而维持RAI14蛋白水平的稳定。通过一系列的体外细胞学实验,我们发现USP42可以延长RAI14蛋白的半衰期,并且通过作用于K48位连接的泛素进行RAI14蛋白的去泛素化。进一步研究发现USP42去泛素化RAI14依赖于其赖氨酸富集区（KK domain）与RAI14相结合以去除其泛素化链。接下来,体内实验发现RAI14蛋白过度的降解可能会导致F-actin的紊乱,从而导致ES结构的解聚和最终的精子发生阻滞。综上所述,USP42可以通过去泛素化的功能而调节RAI14蛋白的稳定,进而维持ES结构而调控精子发生。本文揭示了去泛素化酶在精子发生过程中的重要作用,并且可能为临床无精子症患者的基因检测与治疗提供新的靶点。