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目的:颞下颌关节(Temporomandibular Joint,TMJ)炎症是颞下颌关节紊乱病的一个重要分类,常伴有关节区疼痛,严重影响患者的生活。然而迄今为止,我们对颞下颌关节炎症及其疼痛的机制还了解甚少。近年来,蛋白酶激活受体(Protease-Activated Receptors,PARs)在关节炎症的研究中被广泛关注,并且研究显示,PAR4(Protease-Activated Receptor4)在膝关节的炎症和疼痛过程中发挥重要的作用。PAR4能够通过促进白细胞滚动、粘附和募集等参与炎症反应,并且可以通过激肽释放酶-激肽系统引起疼痛反应。动物实验研究显示,PAR4通过激活ERK1/2(Extracellular Signal-Regulated Kinases 1 and 2)通路促进降钙素基因相关肽(Calcitonin Gene-Related Peptide,CGRP)的表达,进而参与大鼠足底炎症和疼痛反应。然而,对于PAR4是否参与颞下颌关节炎症反应及疼痛,还缺乏相关研究报道。本课题组前期研究也提示,在完全弗氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)诱导的TMJ炎症模型中,三叉神经系统通过调节初级伤害性受体内CGRP的表达参与TMJ炎症过程。本研究利用通过TMJ上腔内注射CFA建立的大鼠TMJ炎症动物模型,观察TMJ炎症过程中三叉神经节中PAR4、ERK1/2和CGRP的动态表达。应用 PAR4 激动剂(PAR4 activated-peptide,PAR4-AP)、ERK1/2 磷酸化抑制剂PD98059等特异性信号因子抑制剂,解析TMJ炎症过程中PAR4、ERK1/2和CGRP的信号调节关系,探讨三叉神经系统PAR4、ERK1/2和CGRP信号转导通路在TMJ炎症过程中的参与作用及可能机制,为临床颞下颌关节炎症及其炎性疼痛的治疗提供实验依据。材料和方法:成年Sprague-Dawley雄性大鼠30只(180-220g,由大连医科大学SPF动物实验中心提供),按如下方法分组及建立实验模型:naive组3只,不做任何处理;CFA组15只,颞下颌关节上腔内注射CFA诱发TMJ炎症;PD98059组3只,尾静脉注射PD98059抑制ERK1/2活性,30min后固定动物;CFA+PD98059组3只,尾静脉注射PD98059,30min后TMJ上腔内注射CFA,72h后固定动物;PAR4-AP组3只,TMJ上腔内注射PAR4-AP激活PAR4,72h后固定动物;PAR4-AP+PD98059组3只,尾静脉注射PD98059,30min后TMJ上腔内注射PAR4-AP,72h后固定动物。应用免疫荧光染色标记的方法,分别检测不同实验条件下TG内CGRP、pERK1/2(phospho-ERK1/2,pERK1/2)、PAR4的动态表达,并定量结果进行统计学分析。结果:1.HE染色示,CFA致炎72h后,TMJ滑膜出现明显的增殖反应,皱褶增多;CFA致炎2w后,关节腔内可见纤维素样分泌物;CFA致炎4w后,髁突软骨显著增厚,有典型的软骨细胞簇形成;CFA致炎6w后,髁突软骨细胞排列紊乱,软骨下骨细胞反应性增生,表面的纤维层剥脱、软骨缺损。提示关节内注射CFA成功诱导大鼠颞下颌关节炎症。2.免疫荧光结果显示,naive组和CFA组的大鼠三叉神经节内分别可见PAR4、pERK1/2及CGRP阳性神经元细胞。统计分析结果显示,PAR4阳性神经元于CFA致炎24h及72h后显著性增多,随后恢复至正常水平。同时,pERK1/2免疫阳性神经元于CFA致炎72h后显著增多,随后回复至正常水平,CFA致炎6w后再次显著性增多。TG内CGRP阳性神经元于CFA致炎72h后开始显著性增多,持续至6w。CGRP荧光强度统计学分析结果显示,CFA致炎72h后CGRP荧光强度开始显著增加,随后恢复至正常水平,6w后再次显著性增高。3.尾静脉内注射ERK1/2磷酸化抑制剂PD98059后,CFA+PD98059组pERK1/2阳性神经元,与CFA组相比显著性减少,与naive组相比无统计学差异。同时,CFA+PD98059组TG内CGRP荧光平均光密度值显著少于CFA组。4.关节内注射PAR4激动剂72h后,大鼠TG内PAR4阳性的神经元数、pERK1/2阳性神经元数、CGRP荧光平均光密度值均显著增多。而尾静脉注射PD98059的大鼠,PAR4-AP+PD98059组TG内CGRP荧光平均光密度值,与PAR4-AP组相比显著减少,与naive组相比无统计学差异。结论:1.大鼠三叉神经系统内存在PAR4的表达,并且参与TMJ炎症及疼痛发生发展。2.TMJ炎症过程,PAR4通过ERK1/2通路调节TG神经元CGRP表达,参与TMJ炎症及疼痛反应。3.三叉神经系统通过PAR4-pERK1/2-CGRP通路参与大鼠TMJ炎症及疼痛反应。