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副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,HPS）是猪重要的细菌性病原,作为机会致病菌能够感染猪,引起以脑膜炎、多发性浆膜炎以及关节炎为主要特征的猪革拉泽氏病。该菌至少分为15种血清型,临床仍有约25%分离株无法定型,目前中国的主要流行菌株为血清4型和5型,且血清4型的分离率略高于5型。HPS易与其他猪的病原体如猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪链球菌等混合感染,每年对世界范围内的养猪业造成巨大的经济损失,其致病机理和有效防控研究有待进一步探索。HPS可以在健康猪的呼吸道定殖,在应激条件或共感染等情况下,引起猪发病。作为呼吸道病原菌,呼吸道上皮是防御HPS的首道防线。近期研究发现,HPS能在体外侵袭内皮细胞或上皮细胞,但是其通过呼吸道上皮屏障侵入机体的感染机制尚不明确。本研究以HPS能定殖的猪气管上皮细胞（Swine tracheal epithelial cells,STEC）作为该菌感染的细胞模型,同时建立体外呼吸道上皮细胞屏障模型,研究HPS从猪上呼吸道感染的机制,为进一步阐明副猪嗜血杆菌的致病机理提供参考。1.副猪嗜血杆菌4型HPS4-YC株感染猪气管上皮细胞STEC感染模型的建立本研究以HPS能定殖的猪气管上皮细胞STEC作为该菌感染的细胞模型,拟阐明HPS从猪上呼吸道感染的机制。通过Giemsa染色发现,HPS 4型HPS4-YC株可以黏附STEC,且HPS4-YC株对STEC的黏附能力呈现细菌剂量依赖性。研究HPS在不同感作时间和感染复数下的黏附率和侵袭率,发现HPS4-YC对STEC感作时间为2h、MOI=100时黏附和侵袭能力最强。通过测定HPS4-YC株感染的STEC细胞LDH释放量,发现HPS在黏附侵袭STEC过程中,未对感染细胞表现出细胞毒性作用。本研究初步建立了副猪嗜血杆菌感染猪气管上皮细胞STEC的感染模型,为后续的研究打下了基础。2.副猪嗜血杆菌4型感染STEC上皮屏障模型的建立副猪嗜血杆菌通过呼吸道感染机体,高毒力菌株会引起猪的急性全身性炎症反应,且易与其它猪的病原体发生共感染,引起感染猪死亡。本研究用猪气管上皮细胞STEC构建Transwell猪气管上皮屏障模型,以MOI=100细菌感染该模型,检测HPS4-YC株对STEC呼吸道上皮屏障的穿透作用。结果显示在感染的0-7h内,没有细菌穿透过屏障;第8h时,细菌开始穿过呼吸道上皮屏障,约为100CFU,穿透率不到0.001‰,第10h穿透约400CFU;而10h后的细菌的穿透率的急剧加快,12h时穿透屏障数约为2.6×104CFU,约为10h的65倍,穿透率约为0.02‰;14h时CFU达到2.6×105,约为0.22‰,说明细胞屏障被明显破坏,细菌大量穿透屏障。跨上皮/跨内皮电阻值（TEER）作为用于测量内皮和上皮单层细胞培养模型中紧密连接动力学的完整性的定量技术被广泛接受。对HPS感染屏障后屏障的TEER值进行实时记录,发现TEER在6-8h出现了下降明显。为进一步检测HPS4-YC对屏障完整性的影响,利用FITC-葡聚糖（FD-4）检测细胞旁通透性,发现从第6h开始,与对照组相比HPS4-YC感染后FD-4渗透率升高,通透性增加。对HPS感染后的STEC细胞进行LDH测定,发现HPS感染24h,对STEC没有细胞毒性。以上结果说明HPS可以破坏STEC构建的体外呼吸道上皮屏障的完整性,并穿越屏障,且不对STEC细胞产生细胞毒性。3.副猪嗜血杆菌4型感染STEC对紧密连接蛋白的影响猪气管上皮细胞是副猪嗜血杆菌能定殖的宿主细胞,前期试验已经验证HPS可以穿透猪气管上皮屏障模型,增加细胞旁通透性,破坏屏障完整性。上皮屏障主要由紧密连接和黏附连接维持,这些连接结构在呼吸道上皮中形成根尖连接复合物。本试验将STEC单层细胞与HPS4-YC株共同孵育,检测感染细胞不同感染时相紧密连接蛋白（TJ）的mRNA水平。发现HPS4-YC感染的STEC细胞 ZO-1、occludin、claudin-1转录水平下调且差异显著,而claudin-4的转录水平有所升高;免疫印迹试验发现,ZO-1、occludin和claudin-1的蛋白表达量均发生减少;间接免疫荧光共聚焦结果同样提示紧密连接分布的完整性被破坏。以上研究结果表明,HPS可以通过下调紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1的转录和表达,破坏紧密连接结构,突破猪气管上皮细胞屏障。