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国内外研究结果表明,IKBKE（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit epsilon）为促癌基因,在乳腺癌,前列腺癌,非小细胞肺癌,子宫内膜癌和胶质瘤中过度高表达。我们课题组前期研究证实,IKBKE基因在人脑胶质母细胞瘤中异常高表达,并且表达量与胶质母细胞瘤患者预后呈负相关,且与人胶质母细胞瘤的恶性程度呈正相关;沉默IKBKE基因的表达,显著抑制人胶质母细胞瘤细胞的增殖能力、侵袭能力及迁移能力。在本论文研究中,我们通过CGGA,TCGA和GEO公共数据库及胶质瘤组织芯片发现IKBKE在胶质瘤中高表达,并且与胶质瘤的恶性程度呈正相关与患者预后呈负相关。另外,我们通过SILAC标记磷酸化定量蛋白质组学检测发现IKBKE能够直接磷酸化Amotl2的丝氨酸166位点。通过phos-tag磷酸化胶和蛋白质泛素化实验进一步证实IKBKE直接磷酸化Amotl2,并且促进其发生泛素化降解。此外,在胶质瘤中Amotl2与YAP1相互作用,抑制YAP1核移位并促进其降解,我们实验证实IKBKE可以解除Amotl2对YAP1抑制作用,促进YAP1的表达及核转位,从而参与Hippo通路的调控作用。在体内实验中,建立裸鼠颅内胶质瘤模型,我们发现沉默IKBKE基因后,明显抑制颅内肿瘤的生长,延长荷瘤鼠的生存期。综上所述,IKBKE能够通过IKBKE↑-Amotl2↓-YAP1↑调控轴调控胶质瘤的恶性进展,为胶质瘤靶向治疗提供新的研究方向。方法我们分析公共数据库CGGA,TCGA和GEO,通过分析IKBKE m RNA的表达量确定IKBKE与胶质瘤的恶性程度及胶质瘤患者的预后的关系。我们收集149例临床胶质瘤样本,进行免疫组织化学染色,确定IKBKE的表达量与胶质瘤级别的关系。我们选取胶质母细胞瘤组织培养出的原代细胞G4和经典胶质母细胞瘤细胞系U87MG用于后续研究。我们构建沉默IKBKE基因的sh IKBKE慢病毒,下调胶质瘤细胞IKBKE基因的表达,然后应用平板克隆,CCK-8和Ed U等细胞增殖实验检测沉默IKBKE基因后,胶质母细胞瘤细胞的增殖情况的变化。分子机制研究中,我们首先沉默U87MG中IKBKE基因进行SILAC标记磷酸化定量蛋白质组学检测,发现Amotl2的s166位点为IKBKE的潜在磷酸化位点。然后我们在293T细胞中分别转染野生型IKBKE或/和野生型Amotl2质粒,通过蛋白免疫共沉淀的方法检测两个外源性蛋白直接结合作用;接着在胶质母细胞瘤细胞系中通过蛋白质免疫共沉淀方法进一步确定内源性IKBKE和Amotl2直接结合的作用。然后,在293T细胞中分别转染野生型IKBKE或/和野生型Amotl2质粒,使用phos-tag磷酸化胶检测IKBKE磷酸化Amotl2的作用关系;为进一步确定IKBKE磷酸化Amotl2的关系,在293T细胞转染野生型Amotl2质粒,然后分别转染IKBKE活性型和失活性质粒,体内激酶实验的方法检测Amotl2中p-ser的表达量变化。通过三个公共数据库根据IKBKE和Amotl2表达量做相关性分析;然后在胶质瘤细胞系沉默或者过表达IKBKE基因后,蛋白免疫印迹和q RT-PCR实验检测Amotl2基因的变化。MG132和CHX试剂处理各组细胞,蛋白免疫印迹实验检测IKBKE促进Amotl2降解的调控作用。最后,293T细胞中转染野生型IKBKE,野生型Amotl2,野生型Ub质粒,通过蛋白泛素化实验确定IKBKE调控Amotl2泛素化降解途径。构建shAmotl2慢病毒敲低Amotl2基因,通过蛋白免疫印迹实验检测Amotl2,YAP1和p-YAP1（s172）的变化;然后蛋白免疫印迹实验检测沉默或过表达后IKBKE后Amotl2,p-YAP1（s172）,YAP1及其下游CTGF和CYR61的变化及沉默IKBKE基因后YAP1细胞浆及胞核内蛋白的变化;通过免疫荧光的方法确定沉默IKBKE基因后YAP1细胞浆及胞核内蛋白的变化。回复实验中,同时沉默或者过表达IKBKE和Amotl2基因后,通过蛋白免疫印迹检测YAP1的变化,通过Edu实验检测细胞增殖的情况。裸鼠颅内成瘤实验中,G4细胞和G4 sh IKBKE细胞转染luciferase成像病毒,使用立体定向仪建立裸鼠颅内胶质瘤模型,定期检测颅内肿瘤的大小、裸鼠生存状态及裸鼠生存时间,最后将裸鼠脑制成组织切片免疫组化检测各指标变化。结果1.IKBKE基因在胶质瘤中异常高表达,与胶质瘤的恶性程度呈正相关,并且表达量越高患者预后越差;2.沉默IKBKE能显著抑制胶质瘤细胞的增殖能力;3.IKBKE能够与Amotl2直接结合,并且能够磷酸化Amotl2;4.IKBKE可以促进Amotl2发生泛素化降解;5.沉默IKBKE可以显著增加Amotl2蛋白的表达,但不影响Amotl2 m RNA的表达,过表达IKBKE则抑制Amotl2蛋白的表达,同样但不影响Amotl2 m RNA的表达;6.IKBKE能够通过调控Amotl2的表达,而影响Hippo通路,沉默IKBKE能抑制YAP1及其下游靶基因CTGF和CYR61的表达,过表达IKBKE能够增加YAP1及其下游靶基因CTGF和CYR61的表达;7.沉默IKBKE能够抑制YAP1从细胞浆向细胞核转运;8.胶质瘤细胞中,Amotl2明显抑制IKBKE对Hippo通路的影响;9.沉默IKBKE可以显著抑制裸鼠颅内肿瘤生长,延长荷瘤鼠的生存时间。结论1.IKBKE基因在胶质瘤中异常高表达,表达量与胶质瘤恶性程度正相关,与患者预后负相关;2.沉默IKBKE基因,能够显著抑制人胶质母细胞瘤细胞体内、体外的增殖能力,并且明显延长荷瘤鼠的生存时间;3.IKBKE能够直接磷酸化Amotl2;4.IKBKE能够促进Amotl2发生泛素化降解,抑制Amotl2的表达;5.IKBKE能够阻断Amotl2对YAP1的抑制作用,促进YAP1的表达及核转运,从而参与Hippo通路的调控胶质瘤的恶性进展;综上所述,IKBKE能够通过IKBKE↑-Amotl2↓-YAP1↑信号通路参与胶质瘤的恶性进展。