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在脓毒症的早期,丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和信号转导及转录激活因子3（STAT3）通路分别被直接和间接的激活。MAPK通路是真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号转导系统;Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）通路是脓毒症中重要的信号通路之一,参与多种重要炎症因子的信号转导及调控。在机体的脓毒性反应中内毒素（脂多糖,LPS）起触发剂的作用,它激活MAPK通路后,肿瘤坏死因子（TNF）-α、白介素1β（IL-1β）等多种炎性细胞因子大量生成,其具体机制已基本清楚。其中TNF-α作为一种重要的早期炎症介质,又间接激活JAK/STAT途径,STATs活化后直接进入核内参与LPS诱导的基因表达。在这一病理过程中,STAT3被激活,晚期炎症介质——高迁移率族蛋白B1（HMGB1）合成和释放增加,这两者均可引起TNF-α的表达增强,但其具体信号转导机制仍不清楚。许多资料表明,参与脓毒症的信号通路之间存在着复杂的交汇作用,其中STAT3蛋白序列中含有简单、高度保守的MAPK磷酸化位点;而细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基未端激酶（JNK）和p38都可以磷酸化STAT3的727位丝氨酸位点,其中ERK1/2和p38与STAT3密切相关。因此,一方面我们假设ERK2与p38和STAT3之间存在相互作用,并在LPS介导TNF-α的基因表达方面具有调节作用;另一方面,本研究拟进一步探讨STAT3和HMGB1在TNF-α启动子的作用位点,为深入认识HMGB1相关信号通路的分子基础及其干预途径提供理论依据。为了验证第一方面的假设,我们应用免疫共沉淀的方法对p38与STAT3、ERK2与STAT3的结合情况进行了研究,结果发现,p38与STAT3、ERK2与STAT3在体内均存在相互作用。在此基础上,我们对这种相互作用在LPS介导TNF-α基因表达中的机制进行了探讨。为了进行免疫共沉淀实验,首先将人的p38和ERK2利用特异性引物扩增得到,并将其克隆到带有HA标签的pcDNA3载体上。然后将Flag-STAT3分别和HA-p38与HA-ERK2质粒共同转染293T细胞后,将细胞裂解并进行免疫共沉淀。结果证实,在细胞的上清中用抗Flag抗体偶合磁珠检测到STAT3蛋白表达,其后使用抗HA抗体分别检测到p38/ERK2蛋白表达,说明STAT3蛋白与p38/ERK2蛋白在体内存在相互作用,为下一步实验奠定了基础。在将HA-p38和Flag-STAT3与TNF-α启动子全长报告基因共同转染293T细胞后,检测它们是否共同协调TNF-α启动子的活性。结果发现,p38和STAT3在刺激前后不仅单独可以调节TNF-α启动子的活性,而且可以协同调节其活性;在将HA-ERK2和Flag-STAT3与TNF-α启动子全长报告基因共同转染293T细胞后,检测它们是否共同协调TNF-α启动子的活性。结果显示,ERK2和STAT3在刺激前后不仅单独可以调节TNF-α启动子的活性,而且可以协同调节其活性。在RNA干扰实验中观察如果阻断STAT3通路,p38/ERK2和STAT3的协同作用将被降低,TNF-α的合成将随之减少。为了证实这一想法,将STAT3的干扰质粒与p38/ERK2和STAT3质粒混合物共同转染细胞,进行TNF-α启动子全长报告基因的活性检测。结果发现,如果应用STAT3的干扰RNA抑制STAT3的表达,p38/ERK2和STAT3对TNF-α的协同效应将被抑制。为了探讨STAT3在TNF-α启动子的作用位点,我们首先将Flag-STAT3与全长TNF-α启动子报告基因共同转染COS-7细胞,观察STAT3作用的剂量-效应。结果证实,STAT3对TNF-α基因的表达不受LPS调节,无论是否有LPS刺激,随着STAT3剂量的增加,TNF-α基因的表达亦随之增加。在将200 ng/ml浓度的Flag-STAT3质粒分别和不同长度的TNF-α启动子报告基因质粒共同转染COS-7细胞并用LPS刺激,观察不同片段的TNF-α启动子活性。结果发现,95 bp片段的TNF-α缺失突变体作用最明显,增加了6.9倍。其次,我们分别构建了70 bp、75 bp、80 bp和85 bp片段的TNF-α缺失突变体——pTNF-α（70bp）、pTNF-α（75 bp）、pTNF-α（80 bp）和pTNF-α（85 bp）,并将它们与Flag-STAT3共同转染COS-7细胞并用LPS刺激,观察到85 bp片段的活性与95 bp片段相似,当片段到达80 bp时,活性降低到对照水平。为了进一步了解其精确结合位点,我们将85 bp片段突变体的81和82位碱基突变,检测其对TNF-α活性影响,发现启动子活性下降。最后,为了证明STAT3的潜在结合位点在80 bp到85 bp之间,且81和82位这两个位点的突变确实改变了STAT3对TNF-α启动子活性,我们进行凝胶迁移阻滞实验,观察到TNF-α启动子62-85 bp的野生型γ-p32标记的探针可以与核蛋白STAT3结合,而突变的62-85 bp标记的探针不能与核蛋白STAT3结合。在探讨HMGB1在TNF-α启动子的作用位点实验中,我们首先将人的HMGB1构建到带有HA标签的pcDNA3载体上。其次,HA-HMGB1与全长TNF-α启动子报告基因共同转染COS-7细胞并用LPS刺激,观察HMGB1作用的剂量-效应。结果发现,随着HMGB1从100 ng/ml增加到1500 ng/ml,TNF-α启动子的活性先增加后降低。在将300ng/ml HMGB1与不同片段TNF-α报告基因共同转染细COS-7细胞并用LPS刺激后,发现在启动子95-120碱基之间的一个经典的内毒素作用位点NF-IL6位点可能是HMGB1作用于TNF-α启动子的主要作用部位。通过上述研究可以得出以下结论:1.STAT3和p38/ERK2蛋白在体内存在相互作用。2.在LPS刺激下,STAT3与p38、STAT3与ERK2均对TNF-α的表达发挥协同效应。3.在阻断STAT3通路后,STAT3与p38、STAT3与ERK2对TNF-α表达的协同效应将明显降低。4.STAT3对TNF-α的基因表达的调节不依赖LPS刺激。5.STAT3在TNF-α启动子的潜在结合位点在80到85碱基片段之间。6.HMGB1对TNF-α基因表达的调节依赖于LPS刺激。7.HMGB1在TNF-α启动子的可能作用部位在经典的内毒素作用位点——NF-IL6位点。