论文部分内容阅读
果糖基转移酶能够催化果糖基单元从一个蔗糖分子转移到另一个分子蔗糖的一类酶(EC2.4.1.9),属于胞外内切酶,该类酶属于糖苷水解酶32(GH32)和68(GH68)的家族。微生物来源的果糖基转移酶催化活性高,耐受高温,且不受季节限制,在工业生产中具有重要意义。三氯蔗糖作为一种新型非营养型低聚果糖,具有甜度高,味质好,无热量和安全性高的功能,且具有良好的理化性质,耐热,耐酸,适用于培烤食品、饮料、糖果和医药制剂中,是迄今为止人类开发的一种最完美最有竞争力的强力甜味剂,在现有的合成途径中,蔗糖-6-乙酸酯是三氯蔗糖合成的关键中间体。生物酶法制备蔗糖-6-乙酸酯是近年来研究热点,以蔗糖与葡萄糖-6-乙酸酯为底物,经果糖基转移酶催化作用生成蔗糖-6-乙酸酯。该方法具有高效专一性、副产物少,转化率高的优势,应用潜力极大。本文首先在我们前期试验中,从一株米曲霉发酵液的中筛选到一种新型的果糖基转移酶Ao FT,发现其粗酶具有较高催化合成蔗糖-6-乙酸酯的活性。为了得到纯化的米曲霉果糖基转移酶Ao FT,发酵液经过硫酸铵沉淀法、Q-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephacryl S-200凝胶过滤等步骤,获得纯化的的米曲霉果糖基转移酶,经过SDS-PAGE电泳,显示为单一条带,分子量约为50 k Da;经过MALDI-TOF MS分析该酶的肽指纹图谱,表明该酶Ao FT具有GH32家族的保守活性中心序列FRDPXVFW和GXXXECPX;通过HPLC和LC-MS检测纯化果糖基转移酶Ao FT活性,发现该酶具有较高转果糖基活性,将蔗糖分子中果糖基转移至葡萄糖-6-乙酸酯,生成蔗糖-6-乙酸酯和葡萄糖。对米曲霉果糖基转移酶Ao FT的酶学性质进行了详细的研究。发现该酶最适反应温度和最适p H分别为45℃和6.0,在温度范围30-50℃处理1 h可以保持80%活性以上;果糖基转移酶Ao FT还具有较高的p H稳定性,在p H4.5-7.5之间处理1 h可以保持80%活性以上。此外,该酶对大多数的金属离子、表面活性剂(Tween20、Triton-X100)和有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、甲醛、DMF、DMSO等)具有较好的抗性。变形剂SDS和尿素对该酶活性抑制作用较强,但是该酶转糖基活性不受EDTA抑制,表明该酶不是金属酶。初步分析了米曲霉果糖基转移酶Ao FT在不同属性离子液体中的催化活性,发现了果糖基转移酶Ao FT在不同的离子液体中催化活性不同。在六氟磷酸盐类离子液体转糖基活性具有明显激活作用,尤其在[Dmim][PF6]的离子液体中蔗糖-6-乙酸酯的产率提高到30.5%,在四氟硼酸盐类离子液体转糖基活性具有明显抑制作用,[Om Py][BF4]的离子液体中蔗糖-6-乙酸酯的产率降到3.73%,但在其他的离子液体中该酶的活性变化不大。利用傅里叶变换红外光谱FT-IR和圆二色谱法CD对酶Ao FT分子构象中进行分析,发现果糖基转移酶Ao FT在离子液体中二级结构变化与催化活性紧密相关。发现在疏水性的六氟磷酸盐类离子液体中酶的α-螺旋含量降低,β-折叠含量越升高,酶的催化活性升高。如在[Dmim][PF6]离子液体中α-螺旋含量降至为9.4%,β-折叠含量增到46.2%,酶的催化活性提高了54.8%。在亲水性的四氟硼酸盐类离子液体中酶的α-螺旋含量和β-折叠含量产生变化,酶的催化活性受到抑制。如在[Om Py][BF4]中α-螺旋含量为12.3%,β-折叠含量为42.5%,酶的催化活性降低了82.2%。在其他的离子液体中酶的二级结构含量的变化对酶催化活性有影响。