研究背景在大多数国家,乳腺癌已经成为女性死亡的主要原因之一。尽管各种检测和治疗手段有了飞速进展,晚期乳腺癌的中位生存期仍在两年左右,有10%左右的病人在确诊乳腺癌时已有远处转移,接近70%的病人最终发生远处转移,并且因此不治。乳腺癌的远处转移已经成为临床治疗中相当棘手的一个问题。成熟的化疗和分子靶向药物方案,辅以内分泌治疗及双磷酸盐等药物,能够显著延长转移性乳腺癌患者的生存时间和生存质量,但较之未发生转移的乳腺癌,晚期乳腺癌仍被归为不可治愈的疾病,目前的药物治疗仍属于姑息性的治疗方案。因此,探索乳腺癌发生转移的机制及寻找特异性抑制这一过程的药物,成为肿瘤学家们的迫切任务。TRP通道由六个跨膜域构成,与电压门控钾离子通道相似,不同的是TRP通道对离子的选择性较差,能同时允许多种离子通过,其中包括了钙离子。最早发现瞬时感受器电位通道的是果蝇(Drosophila melanogaster)眼中的光激活离子通道TRP和TRPL,存在于哺乳动物之中的瞬时感受器电位通道是它们的同源体。TRP 受体分为三个家族:classic(TRPC),vanilloid(TRPV),和 melastatin(TRPM)。研究发现,TRP通道广泛参与了各种恶性肿瘤的发生发展过程,并在其中扮演迥异的角色。TRPM7通道通过改变肿瘤细胞的骨架及细胞间连接,增强乳腺癌细胞的转移能力。同时,TRPM7作为上皮生长因子(EGF)和缺氧诱导的下游因素,在乳腺癌细胞的上皮间充质转化(EMT)起重要作用。有研究表明TRPV6是预测前列腺癌患者预后的不良因子,并且在细胞实验中,通过干扰下调TRPV6的表达能够抑制前列腺癌细胞的增殖。相反的是,TRPV2在神经胶质瘤的研究中被发现是预后良好的标志,它可能通过抑制胶质瘤细胞增殖,并抑制肿瘤细胞对Fas诱导凋亡的抵抗,从而改善胶质瘤患者预后。钙离子是各种生物体重最常见的信号转导因子,它可以直接与下游蛋白结合从而产生效应,更多的是,钙离子通过与它的适配器结合,激活下游的因子,引起生物学效应。生理情况下,细胞内游离钙离子浓度在100nM左右,比胞外低20000倍之多。因而一旦钙离子通道开放,细胞内钙离子浓度将有显著的升高。钙离子的升高一方面可以与细胞中的骨架、马达蛋白等直接相作用影响细胞形态变化和运动,另一方面作为信号转导因子,引起下游一系列的级联反应。大量的研究表明钙离子在细胞迁移行为中起着核心作用,而细胞迁移又是恶性肿瘤发生转移的关键。细胞迁移,是一个由细胞骨架运动和细胞黏附相互整合的过程。在迁移的过程中,细胞首先延长突出部,出现形态的极化,这一现象是由肌动蛋白聚合形成纤维肌动蛋白,并通过细胞骨架附着于细胞外基质引起的。紧接着,以f-actin(纤维肌动蛋白)为“支架”,在肌球蛋白的介导Ⅱ下,f-actin收缩,细胞尾部的黏着斑解体,导致细胞尾部回缩,并与尾端细胞外基质断离。细胞外与细胞内的钙离子在细胞运动的整个过程中都起着无可替代的作用。出现了极化的细胞内存在着一个钙离子梯度:细胞运动前部的钙离子浓度最低,而尾部则最高。细胞运动尾部高浓度的钙离子浓度能引起肌球蛋白Ⅱ的收缩,进而使细胞尾部产生回缩效应。细胞内局部钙离子浓度也不是持续稳定的,它以所谓的“钙闪烁”形式发生波动。随着钙离子信号的波动,细胞内及胞间出现黏着斑的翻覆,肌动蛋白聚合,随之出现突出部的延伸。TRPV6广泛表达在肾脏及肠道组织中,并在这些组织的钙离子吸收起着重要作用,参与调节细胞内钙离子稳态。明显不同于TRP家族其他通道的是,TRPV6有着稳定而持续的2价离子通透性,而这种通透性对钙离子又具有很强特异性。它所介导的钙离子转运并不会伴随着钠离子、氯离子等的转移。TRPV6亦常见于各种肿瘤组织,大鼠嗜酸性粒细胞白血病细胞株、人JurkatT细胞淋巴瘤细胞株、人前列腺癌、乳腺癌和结肠癌等组织等都发现了发现有TRPV6的表达。在前列腺癌中,高级别的肿瘤组织有着丰富的TRPV6表达,而低级别肿瘤组织及正常前列腺组织TRPV6的表达量则很少。亦有研究表明,前列腺癌胞内钙离子浓度的增加与肿瘤细胞的增殖及凋亡抑制相关。而Schwarz等人也发现TRPV6能提高HEK细胞(人胚肾细胞)中钙离子浓度,并促进细胞增殖。结肠癌细胞株SW480和慢性粒细胞白血病细胞株K-562中TRPV6有着表达。Dhennin-Duthille等人发现TRPV6在人乳腺癌导管腺癌组织中的水平高于正常乳腺组织,并且它在在侵袭性的癌组织中增加更为明显;TRPV6的表达沉默能抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞迁移能力。研究目的本实验旨在从临床到基础的角度,探索TRPV6在乳腺癌转移中的意义及其影响转移的细胞水平机制。乳腺癌的远处转移已经成为临床治疗中相当棘手的一个问题,探索乳腺癌发生转移的机制及寻找特异性抑制这一过程的药物,成为肿瘤学家们的迫切任务。TRPV6广泛表达在肾脏及肠道组织中,并在这些组织的钙离子吸收起着重要作用,参与调节细胞内钙离子稳态。Dhennin-Duthille等人发现TRPV6在人乳腺癌导管腺癌组织中的水平高于正常乳腺组织,并且它在在侵袭性的癌组织中增加更为明显;TRPV6的表达沉默能抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞迁移能力。因此在本实验中,我们着重研究TRPV6在乳腺癌组织中的表达情况及其与临床病理指标的相关性,探讨MCF-7细胞过表达TRPV6与细胞内钙离子变化的关系,及TRPV6所引起的钙离子变化对细胞迁移能力的影响和其中机制。方法(1)我们收集自2011年7月至2013年3月在南方医科大学南方医院乳腺外科行乳腺癌根治术的46例乳腺癌浸润性导管癌病例的病理标本和临床资料及30例正常乳腺组织标本作为免疫组织化学实验的染色对照。TRPV6着色强度分成4个水平,0代表TRPV6分子无染色,1代表TRPV6分子弱染色,2代表TRPV6分子中等强度染色,3代表TRPV6分子强染色。将阳性细胞百分比分成5级,无阳性细胞为0分,阳性细胞≤25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,>75%为4分。根据TRPV6分子染色强弱程度将其分为高表达和低表达二个等级着色强度几分与数量积分相加,0～3分判定为低表达,4～7分判定为高表达。并结合乳腺癌组织临床病理指标等级进行分析。(2)在细胞水平,Western blot验证TRPV6在三株不同侵袭性的乳腺癌细胞上的表达,并通过慢病毒感染MCF-7构建过表达TRPV6的MCF-7细胞稳转株V6和转染了空载体的NC组,在此基础上通过siRNA干扰下调细胞中TRPV6表达建立siV6组,进行功能实验。(3)Western blot验证过表达稳转株及siRNA干扰组构建成功后,进行Transwell迁移实验比较V6、NC、siV6和V6+EGTA各组细胞的迁移能力,在200倍镜下随机选取5个视野进行细胞数统计,应用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析;并通过Fluo-3 AM钙离子探针对V6、NC和V6+EGTA各组细胞进行钙离子显像,记录局部钙离子浓度变化,应用SPSS 13.0软件制作钙离子浓度变化线图。(4)通过鬼笔环肽标记f-actin(纤维肌动蛋白),用激光共聚焦扫描显微镜进行荧光现象,并通过Image J软件对荧光进行定量,比较V6、NC和V6+EGTA各组细胞f-actin表达量差异。通过p-MYL9抗体标记p-MYL9(磷酸化的肌球蛋白轻链),用激光共聚焦扫描显微镜进行荧光现象,并通过Image J软件对荧光进行定量,比较V6、NC和V6+EGTA各组细胞p-MYL9表达量差异;另外通过Western blot对p-MYL9进行检测,应用Image J软件进行半定量分析,比较V6、NC和V6+EGTA各组细胞p-MYL9表达量差异。实验数据以均数±标准差(x±SD)表示,两组间比较用SPSS13.0统计分析软件进行t检验,多组间比较采用one-way ANOVA检验,组间两两比较使用LSD检验,以p<0.05为有统计学意义,所有统计结果均使用SPSS13.0作图。结果(1)TRPV6在乳腺癌及正常乳腺癌组织中均有表达,主要表达在细胞膜上,胞浆亦有少部分表达;以PBS代替一抗的阴性对照中未出现染色。在乳腺癌组织中阳性表达率为52.2%(24/46),在正常乳腺组织中阳性表达率为26.7%(8/30),乳腺癌中TRPV6阳性表达率高于正常乳腺组织,χ2检验提示差异有统计学意义(p=0.028)。TRPV6表达水平与乳腺癌组织临床病理指标ER、Her-2、Ki67及病理等级表达情况无显著相关(p>0.05,χ2检验)。TRPV6与乳腺癌淋巴结转移程度显著相关(p=0.012,χ2检验),高TRPV6表达水平的乳腺癌患者可能有更多的淋巴结转移。(2)MCF-7、MDA-MB-468、MDA-MB-231细胞是三株侵袭性递增的乳腺癌细胞系,在这三株细胞的Western Blot中,我们发现侵袭能力较强的 MDA-MB-468(2.47±0.08)、MDA-MB-231(2.45±0.18)细胞有着较高的TRPV6表达,而MCF-7的表达水平则很低(1.14±0.11)。(3)Western blot实验检测发现,经慢病毒感染过表达TRPV6的MCF-7细胞(V6组)有较高的TRPV6蛋白表达(2.85±0.35),转染了空白对照载体的NC组则蛋白表达水平很低(0.94±0.07),V6组经siRNA干扰下调TRPV6表达后(siV6组),TRPV6表达水平则更低(0.74±0.17)。(4)Transwell迁移实验表明TRPV6的高表达能增强MCF-7细胞的迁移能力(121.60±25.54个/视野vs 77.80±12.07个/视野,p<0.001),而siRNA干扰使TRPV6发生沉默后,MCF-7细胞迁移能力则明显下降,而细胞外的钙离子螯合剂EGTA,也能够明显削弱过表达TRPV6的MCF-7细胞的迁移能力,而且这一削弱效应明显强于通过siRNA下调TRPV6的表达(siV6 组(67.40±19.53 个/视野)vs V6+EGTA 组(14.00±5.48 个/视野),p<0.001)(图2-2B)。(5)TRPV6在乳腺癌细胞MCF-7中的过表达能增强细胞内局部钙离子浓度周期性升高的现象,而这一能力可被细胞外钙离子螯合剂EGTA所阻断。(6)V6的f-actin平均荧光密度为0.066±0.010,与NC组的0.042±0.028及V6+EGTA组的0.030±0.011相比较高,并且差异有统计学意义(V6 vs NC,p=0.001;V6vsV6+EGTA,p<0.001)。(7)p-MYL9 在 3 组细胞中的荧光定量,V6 组平均荧光强度(0.10±0.027)明显强于 NC(0.061±0.036)、V6+EGTA(0.036±0.010)组,差异有统计学意义(V6vsNC,p=0.030;V6vsV6+EGTA,p=0.008)。Western blot的蛋白条带进行灰度定量:V6组p-MYL9条带校正后的灰度值 5.43±0.15,高于 NC 组(4.37±0.04)及 V6+EGTA 组(3.82±0.82),差别有统计学意义(V6vsNC,p<0.01,V6vsV6+EGTA,p<0.01)。结论我们的免疫组化实验发现,乳腺癌中TRPV6表达水平高于正常乳腺组织,差异有统计学意义,并且在乳腺癌中,TRPV6表达程度与淋巴结转移程度呈正相关。另外在细胞株Western blot实验中也验证了 TRPV6蛋白在高侵袭性乳腺癌细胞的表达。通过慢病毒介导的基因转染技术,我们构建了过表达TRPV6的MCF-7稳定细胞株V6,并通过siRNA干扰抑制V6细胞TRPV6的表达作为siV6组,转染空载体的MCF-7细胞作为对照组,另外设V6细胞培养基中加了 5mmol/LEGTA的V6+EGTA组。对各组细胞内钙离子显像发现V6组细胞有更强的钙离子浓度爆发波,提示TRPV6过表达能增强MCF-7的钙闪烁幅度,而这一效应能被细胞外钙离子螯合剂EGTA抵消。Transwell实验提示较之NC组及siV6组,TRPV6的过表达能促进MCF-7细胞的迁移能力,而这一增强作用也能被EGTA所抵消。在探究TRPV6促进细胞迁移机制的实验中,我们发现V6组细胞有着更高的f-actin浓度和p-MYL9表达,NC组则较低;但加入EGTA螯合钙离子后,这种表达优势就消失了。我们因此推测,TRPV6的过表达通过增加钙离子内流从而促进MCF-7细胞的迁移能力,而这一效应可被EGTA抵消,而且比NC组降低更明显,可见钙离子通过多种通道、多种方式影响着细胞的运动能力。由机制探究可知,TRPV6的过表达,引起细胞内钙离子内流增加,可能通过促进肌动蛋白单体聚合成纤维肌动蛋白,进而促进板状伪足的形成、细胞运动前部的突出延伸;也可能通过激活肌球蛋白,进而引起细胞的收缩,与尾端细胞外基质的分离。