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性别决定和性别分化是脊椎动物性腺发育的两个关键事件，涉及多种转录因子、生长因子和性类固醇激素，如Dmrtl、Amh、雌激素等。同样作为性类固醇激素的雄激素却不参与性别决定，而是与精子发生有着密切的关系。Dmrt1(Doublesexandmab-3relatedtranscriptionfactor1)是DM家族成员之一，是迄今发现的从无脊椎动物到人最保守的与性别决定相关的基因，它所编码的蛋白质包含一个具有DNA结合能力的保守基序，即DM结构域。Amh(Anti-MüllerianHormone)是一种糖蛋白，属于TGF-β超家族,诱导雄性哺乳动物缪勒氏管的退化。真骨鱼类虽然没有缪勒氏管，但仍然有Amh表达，那么，它在真骨鱼类性别分化中发挥怎样的作用，还有待研究。真骨鱼类雄激素11-酮基睾酮(11-KT)合成所必需的关键酶是Cyp11b2(11β-hydroxylase)，它直接催化睾酮转变为11β-羟基睾酮，后者再由11β-HSD催化形成11-KT。真骨鱼类雌激素合成所必需的关键酶是Cyp19a1a(aromatase)，它直接催化睾酮形成雌二醇。Dmrt1、Amh和Cyp11b2在真骨鱼类性腺发育中均有重要作用，在尼罗罗非鱼也有相应研究，但因缺乏相应的抗体，导致其蛋白水平的研究几乎无法开展。故本研究制备了尼罗罗非鱼Dmrt1、Amh和Cyp11b2多克隆抗体，并对其在正常和性逆转尼罗罗非鱼性腺中蛋白水平的表达进行了初步研究。
尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)具有生长速度快、性成熟时间短、繁殖周期短等特点，因此，它是研究性别决定及分化的好材料。且本实验室具有成熟的获得尼罗罗非鱼全雄、全雌鱼苗及人工诱导其性逆转（外源雌激素可诱导XY雄鱼向雌鱼逆转，外源雌激素合成酶抑制剂可诱导XX雌鱼向雄鱼逆转）技术，取材方便快捷，故本实验选择罗非鱼作为实验动物。
本研究利用RT-PCR扩增出完整的Dmrt1、Amh和Cyp11b2ORF(openreadingframe)，将其连接进pColdⅠ表达载体中进行原核表达，重组蛋白经过镍柱亲和纯化并尿素梯度透析复性后免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，利用CNBr激活的Sepharose4B对抗体进行亲和纯化，获得Dmrt1、Amh和Cyp11b2多克隆抗体。之后，利用Westernblot检测1年龄尼罗罗非鱼性腺组织Dmrt1、Amh和Cyp11b2表达，免疫组化方法检测其在尼罗罗非鱼不同发育时期精巢和卵巢组织中表达情况，同时利用实验室已有的Cyp19a1a抗体，检测Dmrt1、Amh、Cyp11b2和Cyp19a1a在性逆转性腺中的表达情况。
Westernblot检测发现，Dmrt1多克隆抗体可以特异的识别Dmrt1重组蛋白，分子量约为35kD，同时，在精巢总蛋白识别单一条带，而在卵巢并未检测到条带，证实Dmrt1抗体具有特异性，且Dmrt1在尼罗罗非鱼只在精巢特异表达，而在卵巢组织几乎不表达。免疫组化检测发现，Dmrt1从性别决定关键时期5dah(dah，daysafterhatching)开始高表达于XY精巢Sertoli前体细胞，在精巢发育后期表达于Sertoli细胞和输精管上皮细胞。同期的XX卵巢中未见表达。而在外源雌激素E2(Estradiol)诱导XY性逆转过程中，到10-15dah时Dmrt1表达量明显降低，到70dah已完全检测不到，Letrozole（雌激素合成关键酶Cyp19ala抑制剂）诱导XX性逆转过程中，Dmrt1在15dah时开始表达，随后表达量逐渐升高，到70dah时与XY对照组没有差别。此结果暗示，Dmrt1在尼罗罗非鱼性别决定、精巢维持及性逆转中发挥至关重要的作用。
同时，检测性逆转尼罗罗非鱼性腺中Cyp19a1a发现，E2诱导XY性逆转过程中，Cyp19a1a在10dah时开始表达，随后表达量逐渐上升，到60dah时与XX对照组没有差别。Letrozole诱导XX性逆转过程中，Cyp19a1a表达量逐渐减少并在60dah时消失。有趣的是，在E2和Letrozole处理10-15dah时，性腺组织同时表达Dmrt1和Cyp19a1a。说明在性逆转过程中，存在雌雄通路的对抗作用。
Westernblot检测Amh多克隆抗体发现，该抗体可特异识别出Amh重组蛋白，分子量约为54kD，且在精巢和卵巢组织同时检测到单一条带，证实Amh抗体具有特异性，且Amh在尼罗罗非鱼精巢和卵巢组织均有表达。免疫组化检测发现，Amh在5-180dah均高表达于卵巢颗粒细胞和鞘膜细胞，及精巢叶边细胞和Sertoli细胞。免疫组化检测性逆转性腺发现，Amh在Letrozole诱导XX鱼性逆转过程中表达量逐渐升高，而在E2诱导XY鱼性逆转过程中表达不明显，直到70dah才检测到微弱的信号。本研究推测Amh在精巢发育早期发挥重要作用，并参与精子发生和精子运输过程，而在卵巢发育早期作用不明显，待卵巢发育到一定时期才发挥作用。
同样的，Westernblot检测发现Cyp11b2抗体可以特异识别出分子量约为64kD的目的条带，即Cyp11b2重组蛋白，同时，该抗体在精巢组织总蛋白识别出一条大约58kD的内源性条带，而在卵巢并未检测到条带，这说明Cyp11b2抗体具有特异性，并且Cyp11b2在罗非鱼只在精巢特异表达，而在卵巢组织不表达。免疫组化检测发现，Cyp11b2特异表达于30dah以后的精巢Leydig细胞，而在性别决定关键时期5dah并不表达。Cyp11b2在Letrozole处理XX雌鱼早期并不表达，在70dah时才检测到信号。推测，Cyp11b2或者Cyp11b2催化合成的产物11-KT调节和维持精子发生，但在性别决定中并不发挥作用。
综上所述，本研究利用原核表达Dmrt1、Amh和Cyp11b2重组蛋白免疫新西兰大白兔制备的多克隆抗体存在特异性，可应用于实验研究。本研究证实，Dmrt1、Amh和Cyp11b2在尼罗罗非鱼精巢发育和维持中也许发挥重要作用，Dmrt1、Amh也许参与尼罗罗非鱼性别决定，而Cyp11b2不参与这一过程。同时本研究对Cyp11b2的研究也支持内源性雄激素在鱼类性别决定及分化中的缺失假说。