miRNA-17-5p对湿性AMD患者抗VEGF治疗的作用及机制研究

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目的:观察湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)患者抗新生血管内皮生长因子(VEGF)药物治疗后房水中微小RNA(miRNA)水平改变,并探讨其与预后的相关性及可能的作用机制。方法:1、选取20例(20眼)湿性AMD患者,签署知情同意书。分别在第一次、第二次行玻璃体腔注射抗VEGF药物时抽取约50ul房水,通过mi RNA衍生片段长度多肽性(miRFLP)直接测定法检测房水中16种可能相关的miRNA水平,分析抗VEGF治疗前后mi RNA水平变化,筛选出有规律变化的miRNA种类,然后比较其与中心视网膜厚度(CMT)变化的相关性。2、采用HUVEC细胞,将与CMT有相关性的miRNA过表达,检测细胞表达的目的基因及蛋白的水平,探讨可能的作用机制。通过TargetScan算法分析该miRNA的潜在靶点,将预测出的靶基因与血管生成强相关的TGF-β家族进行交叉对比,选出实验的目的基因及蛋白。实验分为药物对照组、miRNA mimic组、mimic阴性对照组。通过qRT-PCR检测细胞转染效率以确定实验转染浓度。通过CCK8检测细胞活性以确定实验转染时间。采用上述转染浓度及转染时间进行实验。通过qRT-PCR及Western Blot检测各组目的基因及蛋白的表达水平。结果:1、筛选出抗VEGF治疗前后房水miRNA变化有统计学意义的miR-17-5p(t=-4.134,P=0.001)及miR-146a(t=-4.566,P=0.000);治疗前后房水中miRNA表达量改变与CMT改变的Spearman相关性分析结果显示:miR-17-5p(r=-0.528,P=0.017),miR-146a(r=0.226,P=0.339)。2、选出的靶基因为TGF-β2和GDF11。qRT-PCR结果显示:miRNA(miR-17-5p)最佳转染浓度为50nM。CCK8结果显示:miRNA(miR-17-5p)最佳转染时间为24h。qRT-PCR结果显示:与药物对照组相比,miRNA(miR-17-5p)mimic组的TGF-β2表达水平明显下降(t=26.669,P=0.001),mimic阴性对照组的表达水平无明显变化(t=0.956,P=0.440);与药物对照组相比,miRNA(miR-17-5p)mimic组的GDF11表达水平明显上升(t=-3.357,P=0.028),mimic阴性对照组的表达水平无明显变化(t=-1.420,P=0.292)。Western Blot结果显示:与药物对照组相比,miRNA(miR-17-5p)mimic组的TGF-β2表达量明显下降(t=13.046,P=0.000),mimic阴性对照组的表达量无明显变化(t=-0.559,P=0.632);与药物对照组相比,miRNA(miR-17-5p)mimic组的GDF11表达量明显上升(t=-21.714,P=0.002),mimic阴性对照组的表达量无明显变化(t=0.674,P=0.537)。结论:1、抗VEGF药物治疗后,患者房水中mi RNA-17-5p表达量与黄斑结构改善正相关。2、上调miRNA-17-5p可能通过抑制TGF-β2、促进GDF11的表达,进而参与到抗VEGF治疗的“应答”过程。
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