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梨是我国主要的果树之一,广泛分布于全国各地,梨产业的发展对促进地区经济发展有重要作用。近年来梨产业虽然取得了巨大的进展,但常受到低温,干旱和盐碱等非生物胁迫的影响,因此如何高效提高梨树的抗逆性成为当前迫切需要解决的课题。近年来随着基因工程的发展,为梨的抗逆育种提供了 一条新途径。本研究分别以‘杜梨’和‘山梨’为实验材料,克隆了PbeNAC1和PbeMYB2,PubHLH1和PuALDH2基因,并对它们进行抗逆功能验证。主要结果如下:1.从杜梨中克隆得到PbeNAC1,该基因的开放阅读框全长为927bp,编码了 308个氨基酸,预测的蛋白分子量为35.6KDa,等电点为6.46。进化分析显示PbeNAC1与拟南芥和水稻ATAF家族成员具有较高的同源性。多序列比对显示PbeNAC1同其它物种的NAC氨基酸序列相似,都具有非常保守的N端和一个核定位信号。PbeNAC1是一个核蛋白,并具有转录激活活性。PbeNAC1能够被低温,脱水和盐胁迫诱导。与对照相比,超表达PbeNAC1的转基因烟草具有较强的抗寒和抗旱能力。在低温或干旱胁迫下,与对照相比转基因株系中活性氧的水平更低,三种抗氧化酶的活也更高。此外,在低温或干旱处理前后,15个与抗氧化或抗逆相关基因的表达量也比对照高。进一步研究表明,PbeNAC1能分别与PbeDREB1和PbeDREB2A进行蛋白互作,参与了 DREB所介导的信号通路,超表达PbeNAC1转基因株系抗逆能力的提升可能与此有关。所有结果表明,超表达PbeNAC1提高了转基因植株的抗寒和抗旱能力。2.从杜梨中克隆得到PbeMYB2,该基因的开放阅读框全长为873bp,编码了 290个氨基酸,预测的蛋白分子量为32.8KDa,等电点为5.1。进化分析显示PbeMYB2与拟南芥AtMYB2具有较高的同源性。PbeMYB2是一个核蛋白且具有转录激活活性。PbeMYB2能够受低温,脱水和盐胁迫诱导。超表达PbeMYB2增强了转基因烟草的抗盐能力。在盐胁迫条件下,转基因烟草与对照相比能更有效的清除体内的过氧化氢,5个与清除活性氧或抗逆相关基因的表达量也高于对照。所有结果表明,超表达PbeMYB2提高了转基因植株的抗盐能力。3.从山梨中克隆得到PubHLH1,该基因包含1638bp的开放阅读框,编码了 545个氨基酸,预测的蛋白分子量为59KDa,等电点为6.05。进化分析显示PubHLH1与拟南芥的AtbHLH33具有很高的同源性。结构域检测分析显示PubHLH1拥有一个典型的bHLH结构域。PubHLH1蛋白定位于细胞核上,具有转录激活活性。表达模式分析显示,PubHLH1能对低温,脱水和盐胁迫响应。在烟草中超表达PubHLH1,转基因株系比野生型(对照)植株的抗寒能力显著提高。低温胁迫下,转基因株系积累了更少的活性氧,三种抗氧化酶的活性也比对照高。此外,低温处理前后,转基因烟草中8个与清除活性氧或抗逆相关基因的表达量也比对照高。研究结果表明,PubHLH1转基因株系具有较强的抗寒能力。4.从山梨中克隆出PuALDH2基因,该基因的开放阅读框全长1506bp,编码了501个氨基酸,预测的蛋白分子量为54.7KDa,等电点为6.13。进化分析表明,PuALDH2与拟南芥AtALDH2C4和枳PtrALDH2C4具有较高的同源性。PuALDH2受低温,脱水和盐胁迫诱导。超表达PuALDH2提高了转基因烟草的抗寒能力。在低温胁迫前后,转基因株系中三种抗氧化酶的活性都比对照高,5种与清除活性氧或抗逆相关基因的转录水平也高于对照。这些结果都表明,超表达PuALDH2提高了转基因植株的抗寒能力。