目的:中药降香为降香檀植株干和根部心材,其心材形成(结香)极其缓慢,需50年以上才能成材,现有的人工结香方法均未取得良效。为此,作者开展了生物诱导法诱导降香檀结香新技术研究。方法:1刺激结香实验研究1.1刺激结香方式对降香檀结香的影响选取4年生健康降香檀植株作为实验对象,设计打1孔注液、打2孔注液及输液处理组,实验后分别记录1周、2个月、4个月、6个月的树叶、枝条、树干生长情况,同时详细记录实验后2个月、4个月、6个月、12个月降香檀心材颜色、气味等情况,选择最佳刺激方式。1.2刺激药物对降香檀结香的影响选取4年生健康降香檀植株作为实验对象,分别设计生物诱导剂、青鲜素、双氧水、醋酸、甲酸、噻苯隆组别,实验后观察记录1周、2个月、4个月、6个月的树叶、枝条、树干生长情况,同时详细记录实验后2个月、4个月、6个月、12个月降香檀心材颜色、气味、硬度等情况,选择最佳刺激药物。1.3生物诱导剂最佳浓度及最佳用量的优选选取4年生健康降香檀植株作为实验对象,分别设计4%、6%、8%、10%、12%、14%浓度的生物诱导剂组别、用量分别为80、100、120、140、160mL组别,实验后观察记录1周、2个月、4个月、6个月的树叶、枝条、树干生长情况,同时详细记录实验后2个月、4个月、6个月、12个月降香檀心材颜色、气味、硬度等情况,同时以12个月后产量作为评价指标,选择最佳浓度及用量。1.4降香檀刺激结香技术最佳条件验证及优化选取4年生健康降香檀植株作为实验对象,每组3株,分为生物诱导剂1组(在主干高0.8-1.2m处滴注10%生物诱导剂120mL)、生物诱导剂2组(在主干高1.2m、2.4m两处分别滴注10%生物诱导剂60mL)、生物诱导剂3组(主干1.2m处四面打孔滴注10%生物诱导剂120mL),实验后观察记录1周、2个月、4个月、6个月的树叶、枝条、树干生长情况,同时详细记录实验后2个月、4个月、6个月、12个月降香檀心材颜色、气味等情况,同时以12个月后产量作为评价指标,对生物诱导法结香技术进行优化及验证。2降香檀刺激结香产量与样品质量分析研究2.1降香檀刺激结香产量的初步分析降香檀刺激结香产量计算采用体积法,用钻孔法观察并记录结香高度,胸径,计算公式为结香体积=3.14 ×(胸径/2)2 ×高度。2.2降香檀刺激结香样品质量常规性评价以国内不同地区市售样品、刺激结香6个月、12个月、降香檀对照药材样品做对照进行品质分析。质量分析方法按2010年版《中国药典》(一部)中降香项下要求,检查各批药材的性状特点、显微特征、薄层鉴别等,同时采用依照2010年版《中国药典》(一部)附录Ⅸ H“水分测定法”项下“第二法(甲苯法)”测定含水量;《中国药典》2010年版(一部)附录X A“浸出物测定法——醇溶性浸出物测定法”项下“热浸法”测定醇浸出物含量;用乙醚冷浸法测定醚浸出物含量测定;2010版《中国药典》附录XD挥发油测定法甲法进行降香挥发油含量测定。2.3降香檀刺激结香样品甘草素、异甘草素含量测定及HPLC指纹图谱研究采用HPLC法测定降香檀样品中甘草素、异甘草素的含量,色谱柱SymmetryC18(4.6mm×250mm,5.0μm);流动相:乙腈(B)、0.3%磷酸溶液(C,v/v)梯度洗脱;流速:1mL/min;甘草素、异甘草素检测波长分别为275nm、363nm;柱温:35℃;进样量:10μL。采用HPLC-UV法建立不同批次降香样品的指纹图谱,运用国家药典委“中药指纹图谱相似度评价软件2004A版”对23批样品进行图谱分析比较,确定共有峰及相似度,并采用SPSS20.0进行聚类分析。2.4降香檀刺激结香样品挥发油成分分析及GC-MS指纹图谱的建立采用GC-MS法分析15批降香样品化学成分,HP-5石英毛细管柱;进样口温度250℃;接口温度280℃,载气:氦气,流速:1mL/min;分流比50:1;进样量:1μL;升温程序:柱温60℃,保持2min,以10℃/min升至115℃,保持2min,再以1℃/min升至135℃,保持2min,最后以10℃/min升至280℃,保持2min。建立指纹图谱,并采用“中南大学相似度评价软件”进行相似度分析,应用SPSS20.0进行聚类分析,建立降香檀挥发油质量控制方法。结果:1刺激结香实验研究1.1刺激结香方式对降香檀结香的影响三种方法实验组一周后都出现落叶现象,约1个月后慢慢恢复,2个月后刺激孔部位渗出紫褐色物质,质黏稠,燃烧时有与降香心材相似的香味,约4个月后,大部分注射结香剂的树体在刺激孔周围皮部爆裂现象,而空白对照组及阴性对照组均无此现象出现。6个月及1年后凿开及截断树体进行观察,打1孔注液法、打2孔注液法及输液注液法均可形成棕红色心材类物质,三种刺激方式所产心材类物质产量有显著差异,输液法所影响区域均明显大于打1孔及2孔注液法,且输液法对药液输送速度最快。1.2刺激药物对降香檀结香的影响研究以结香产量、结香质量及安全性评价作为指标对刺激药物进行刺激结香实验结果表明,青鲜素组、甲酸组、乙酸组、生物诱导剂及噻苯隆组均能使降香结香,双氧水组未产生结香效果,刺激药物对降香檀结香产量从高到低为:生物诱导剂>噻苯隆>青鲜素>甲酸>乙酸>双氧水,且生物诱导剂刺激降香檀1年所产的降香颜色深红、香味浓烈,质硬,质量最佳。1.3生物诱导剂最佳浓度及用量的优化研究10%生物诱导剂诱导组一年后降香檀心材长度可达258cm,胸径达8.2cm,心材颜色深红、质硬、香气浓烈,优于4%、6%及8%生物诱导剂组别所产心材质量,而12%及14%浓度时,会出现树体枯萎及死亡现象;10%生物诱导剂用量为120mL刺激组最高心材长度达157cm,宽度8.7cm,心材颜色深红色,香气浓烈;质量均优于其他用量组别,140mL及160mL用量时,植株出现枯萎、死亡现象。1.4降香刺激结香的最佳条件验证及优化研究生物诱导剂1组降香,结香产量达15767.1 cm3/年,显著高于生物诱导剂2组(年均产量14842.2)与生物诱导剂3组(年均产量14937.8)者。生物诱导剂1组样品心材颜色、气味、硬度均已达到9年生自然结香降香,将结香点提前了4年,且能从根部至树干320cm处整体结香,结香胸径约9.0cm。2生物诱导法刺激降香产量与结香样品质量分析研究2.1降香刺激结香产量与样品质量常规评价性状鉴别结果显示6个月所产心材品质较佳,产量平均约2100cm3,12个月结香产量达15767.1 cm3,6个月心材颜色浅棕红色,质地较坚硬,燃烧有白烟,香味较浓烈;显微鉴别发现刺激结香均含药典规定的缘纹孔导管、草酸钙方晶、晶鞘纤维等物质,但不同样品间这些基本特征的量或形态上存在一定的差异,刺激结香样品色素块相对较少,晶鞘纤维、木纤维及木射线为浅棕黄色,方晶多;薄层鉴别发现刺激结香6个月的样品与对照品在不同Rf处位置有相同的斑点;含水量、醇浸出物、醚浸出物含量测定结果显示刺激2、4、6个月结香样品含水量在7.71%～8.74%、醇浸出物含量为9.08%～21.67%、醚浸出物在4.82%～8.96%;挥发油含测结果刺激6个月样品含量为1.92%,刺激12个月样品含量达3.85%。2.2样品黄酮主成分含测及HPLC指纹图谱的建立建立了降香檀甘草素及异甘草素含量测定的HPLC法,该法简单方便,可重复性强。刺激结香6个月降香檀样品甘草素及异甘草素含量分别达2.353、0.848mg/g,降香檀市售药材甘草素含量及异甘草素平均值分别为2.04、0.818mg/g。23批降香檀样品HPLC指纹图谱与生产的对照图谱R的相似度在0.306-0.974之间,聚类分析将23批样品可分为5类,其中刺激12个月样品与大部分市售样品列为一类,刺激2、4月样品与自然结香9年、12年样品列为一类。2.3降香檀刺激结香样品挥发油成分分析及GC-MS指纹图谱的建立降香檀挥发油对照品主要含β-甜没药烯、反式-橙花叔醇及环氧化蛇麻烯,三成分含量高达85%,刺激结香6个月降香檀样品主要含反式-橙花叔醇,β-甜没药烯及环氧化蛇麻烯含量较低,而刺激结香12个月样品三成分含量可达82%。15批样品挥发油(包括市售样品、降香檀油对照品、降香檀刺激结香挥发油样品)相似度在0.3984-0.9127之间,差异较大,仅广东茂名市售样品相似度达0.9以上,生物诱导法结香心材挥发油相似度在0.4385-0.6649之间,相似度较低,聚类分析结果将13批样品分为三类,刺激结香6个月及12个月样品与降香檀挥发油对照品在聚类分析中列为一类。结论:1刺激结香实验研究最佳刺激结香方法为:双侧输液法;刺激结香剂:生物诱导剂;刺激结香剂浓度:10%;结香剂用量:120mL;该法所产降香檀结香心材品质硬、偶有纹理、颜色深红、浓烈香味;心材长度达320cm,心材直径达9cm,1年产量估计达15767.1cm3,产量显著增加,结香时间点提前了4年以上,对降香檀的生产及综合利用具有重大意义。而刺激结香的最适季节、心材采收时间、结香剂在降香檀植株中的输导等需要更进一步的研究。2生物诱导法刺激降香檀结香样品质量分析研究按照2010年版《中国药典》(一部)中降香檀药材的要求,生物诱导法诱导结香样品性状特点、显微特征、薄层鉴别、含水量、醇浸出物含量、醚浸出物含量及挥发油含量等质量标准已经符合药典要求,并高于部分市售样品的质量。刺激6、12个月样品甘草素及异甘草素含量均高于市售样品平均含量。成功建立了刺激结香、市售样品及对照药材HPLC及GC-MS指纹图谱,为后期刺激降香檀结香提供了科学有效的质量评价新方法。HPLC指纹图谱聚类分析表明,刺激12个月样品与大部分市售样品列为一类,GC-MS指纹图谱聚类分析显示生物诱导法诱导结香样品6个月及12个月样品与降香檀挥发油对照品列为一类。质量分析结果表明,本实验采用的生物诱导法所产结香样品已基本符合2010年版《中国药典》对降香檀的各项要求,且结香6、12个月样品优于大部分市售药材。