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普切明是一种由微生物产生的环二肽,因其螯合铁离子,具有较好的抑菌活性,可作为一种有效的生防制剂,在农业、医药和染料等领域具有潜在的应用前景。然而目前由微生物发酵产生普切明的产量普遍较低,无法达到工业化生产水平,限制了普切明的运用。本文的研究目的是通过发酵工艺优化和代谢工程改造提高地衣芽胞杆菌普切明产量,为普切明高效生产奠定基础。主要结果如下:1.地衣芽胞杆菌DW2普切明的分离纯化及鉴定本研究首次对地衣芽胞杆菌DW2发酵产生的红色色素进行鉴定。首先,对纯化的色素进行紫外·可见·近红外光全波长光谱扫描,发现该色素在243 nm,282 nm和410 nm处具有特征吸收峰,与来源于枯草芽胞杆菌和酵母的普切明吸收峰一致。此外通过基因工程手段,构建了普切明合成基因yvmC和cypX的缺失菌株及相应的基因回补菌株,分别命名为DW2ΔcypX,DW2ΔyvmC,DW2ΔyvmC/pHYyvmC和DW2ΔcypX/pHYcypX。发酵结果表明,缺失yvm C和cypX任何一个基因,均不能合成该红色色素;而相应的回补菌株均恢复了合成红色色素的能力。综上结果表明,地衣芽胞杆菌DW2发酵产生的红色色素为普切明。2.地衣芽胞杆菌DW2普切明摇瓶发酵工艺优化以地衣芽胞杆菌DW2基础菌株,使用单因素实验和正交试验相结合的方法,研究培养基成分和发酵条件对DW2摇瓶发酵生产普切明的影响。结果表明,葡萄糖是合成普切明的最适碳源,（NH4）2SO4为最适氮源,外源添加表面活性剂吐温80和酵母粉均能显著提高DW2发酵生产普切明的能力。优化后的培养基是由以下部分构成（g/L）:吐温80 1.0,葡萄糖40,（NH4）2SO4 6.4,酵母粉1.0,,柠檬酸钠12,K2HPO4·3H2O 0.6,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl2·2H2O 0.2,FeCl3·6H2O 0.04,MnSO4·H2O 0.02。且摇瓶发酵优化筛选后最优条件为:初始pH 7.0、种龄10 h、接种量（V/V）2%。在优化的发酵工艺下,DW2的普切明产量可达到313.17 mg/L,较原始产量提高了4.95倍。3.普切明高产地衣芽胞杆菌工程菌株的构建普切明是以亮氨酸为底物,通过亮氨酸氨酰tRNA合成酶催化合成亮氨酸氨酰tRNA,再经YvmC催化形成cyclo（L-Leu-L-Leu）,进一步在Cyp X催化下生成普切明酸,随后普切明酸分泌至胞外,螯合铁离子形成普切明。因此提高亮氨酸合成途径将有利于普切明的合成,同时强化亮氨酸氨酰tRNA合成酶编码基因（leuS）和普切明合成途径基因（yvmC和cypX）的表达,将更加有利于普切明的积累。本研究以地衣芽胞杆菌DW2为基础菌株,分别强化了乙酰乳酸合成酶的编码基因alss和ilvB,亮氨酸氨酰tRNA合成酶编码基因leuS和普切明合成途径基因yvmC。结果表明,重组菌株DW2/pHY-alss,DW2/pHY-ilvB,DW2/pHY-leuS,DW2/pHY-yvmC发酵普切明与转化空质粒菌株DW2/pHY300相比,分别提高0.91%,7.80%,19.40%和12.90%。BkdAB是支链脂肪酸的途径合成关键酶,缺失bkdAB可以弱化支链脂肪酸的合成,从而提高亮氨酸的积累。结果表明,DW2ΔbkdAB普切明产量比野生菌株提高了10%,但缺失bkdAB对菌体生长具有一定的抑制作用。在DW2ΔbkdAB中强化alss,leuS和yvmC-cypX的表达,可进一步提高普切明产量。利用强启动子PbacA分别置换DW2ΔbkdAB菌中ilvB、yvmC、leuS操纵子的启动子,获得一系列启动子置换菌株。结果表明,分别替换yvmC、leuS启动子的菌株普切明产量比DW2ΔbkdAB分别提高了14.5mg/L和4.52 mg/L。并在DW2ΔbkdAB-Pbac A（yvmC）基础上叠加替换ilvB启动子,得到双换启动子菌株,叠加置换启动子菌株能够进一步增强普切明的合成,其普切明产量为366.76 mg/L。并在双换启动子菌株中超表达leuS。结果表明,该菌株普切明产量高达379.93 mg/L,是基础菌株在原始培养条件下普切明产量的7.22倍（52.60 mg/L）。