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人肠道病毒(Enterovirus,EV)D68型是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属的一种病毒,该病毒原名为鼻病毒87型,后划归肠道病毒属。肠道病毒EV-D68的主要易感人群为小儿,侵犯的主要脏器为肺,可引起小儿毛细支气管炎和肺炎。在2010年以前全球一直对EV-D68缺乏重视,全球获得的分离株数量也屈指可数,对EV-D68的研究停留在较低的水平,但是随着全球对健康水平要求越来越高,也由于在2010年之后美国、日本、新西兰等多个国家均出现了 EV-D68的爆发,EV-D68开始引起了全球重视。EV-D68的最近一次爆发出现2014年的北美洲导致了多名患儿死亡,2010年后在我国也分离出多株EV-D68病毒,但未出现大规模的爆发。线粒体在过去的一段时间内一直被大家认为是细胞的能量工厂,为细胞的一系列生命活动提供必要的能量,但是近年来,随着人们更加深入的研究,线粒体逐渐被赋予上了一个新的称号——天然免疫中枢。为了探究肠道病毒-D68型(EV-D68)在感染细胞后,细胞和细胞中的线粒体受到了怎么样的影响。我们将EV-D68感染Hela细胞,通过RealTime-PCR对不同的时间点的细胞中的病毒量进行绝对定量。通过PI染色对不同时间点的细胞进行染色,来对被病毒感染后的细胞周期进行检测。通过透射电镜对被病毒感染的细胞的线粒体形态进行观察。通过WesternBlot来检测线粒体上的ATP合酶的表达量进行检测,来判断线粒体的功能是否受到影响。通过JC-1染色来检测线粒体的内膜稳态在病毒感染后是否受到影响。通过免疫荧光来检测细胞的线粒体在病毒感染后是否出现线粒体DNA(mtDNA)应激的现象。通过结果分析我们发现,EV-D68病毒能够在Hela细胞中正常的增殖。在病毒感染后,被感染的细胞存在于S期的细胞数量增加。对感染后的细胞样本进行透射电镜的观察,我们发现在病毒感染后细胞中的线粒体形态发生了改变,线粒体膜间隙由于嵴的消失出现了融合扩大的现象。线粒体出现一定程度上的皱缩。利用WesternBlot对感染后的细胞中的线粒体上的ATP合酶表达量进行检测,发现在病毒感染后线粒体中的ATP合酶出现了减少的现象,说明在病毒感染后会影响线粒体的产能功能。在利用JC-1对病毒感染后的不同时间点的细胞进行染色,通过流失细胞仪进行检测我们发现,在病毒感染后JC-1单体的数量呈现一个增加的现象,说明病毒感染后会对细胞的线粒体的内膜稳态产生影响。利用免疫荧光,我们在荧光共聚焦显微镜下对病毒感染后的细胞进行观察,我们发现在病毒感染后mtDNA出现的应激的现象。为探究是EV-D68中的哪个蛋白会引起线粒体的应激,通过资料查阅和分析,我们选取VP1、P1、3C和3D这四个蛋白来进行分析检测,我们构建了这四个蛋白的表达质粒转染进293T细胞,结果我们发现P1和VP1这两个蛋白与线粒体应激无关,而3C和3D这两个蛋白与线粒体应激有直接的关系。我们利用RealTime-PCR和Western Blot对全病毒感染和单独的P1、VP1、3C和3D蛋白质粒转染后,引起的线粒体相关蛋白的基因水平和蛋白水平的表达量进行了检测比较。我们发现在基因水平上,全病毒感染和单独的质粒转染均能引起线粒体相关蛋白的基因表达量的变化,但不存在明显的相关性。在蛋白水平上,与全病毒感染相似的是,VP1,P1和3D蛋白均能引起MFN2表达量的上升,同时我们也发现3C蛋白能够降低MFN1和MFN2的表达量。为了探究EV-D68全病毒感染和单独的P1、VP1、3C和3D蛋白转染对固有免疫有什么样的共通的影响,我们利用RealTime-PCR对感染和转染后的细胞中的固有免疫相关细胞因子的基因表达量进行了检测,我们发现3C蛋白和3D蛋白在转染表达后会引起TNF-α和IFN-β基因表达量出现了上调,这与全病毒感染时的情况完全相同。综上所述,EV-D68感染细胞后会对细胞造成一系列的影响,会对细胞中的线粒体产生负面影响,会导致mtDNA产生应激现象。而EV-D68中的3C蛋白和3D蛋白是导致mtDNA产生应激的主要蛋白,对线粒体的相关蛋白的基因水平和蛋白水平上的表达量存在影响。这两个蛋白在EV-D68感染引起的固有免疫反应中,也扮演着一定的角色。