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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由冠状病毒属猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪的一种以腹泻、呕吐和脱水为主要临床特征的高度接触性传染病。猪流行性腹泻无论是流行病学特性、临床症状还是小肠的病理变化都与猪传染性胃肠炎(TGE)和猪轮状(PR)十分相似,单凭临床经验和组织病变只能初步诊断。目前,还没有有效的检测方法区分这三种病毒。近年来又由于猪腹泻频繁爆发、得不到有效控制,已给世界养猪业造成了巨大的经济损失。因此,建立优化快速、准确、简便的检测方法对于PEDV分子生物学研究及临床防制都有重要意义。研究建立了PEDV检测的RT-PCR以及荧光定量PCR方法;PEDV抗体检测的IFA方法和相对定量中和试验方法。PEDV检测的RT-PCR:本实验根据GenBank已登录的PEDV-ORF3基因,利用Primer5.0软件设计合成一对特异性引物,并进行条件优化,扩增PEDV-ORF3全长基因,将片段与载体pMD18-T连接并转化至TOP10感受态细胞,大量提取质粒,测序并分析。建立的RT-PCR方法,通过优化退火温度,确定了最佳反应体系和扩增程序,退火温度确定在52-55℃,敏感性实验结果检测到初始模板中1.86pg的RNA；特异性实验中TGEV、PRV、PRRSV、HEV及阴性对照均为阴性。临床样品检测阳性率达80%。PEDV检测荧光定量PCR方法：根据GenBank已登录的PEDV M基因,利用Primer5.0软件设计合成一对特异性引物,RT-PCR扩增出特异性目的片段,目的片段与载体pMD18-T连接并转化至TOP10感受态细胞,大量提取质粒,酶切鉴定。重组质粒测浓度并根据公式计算拷贝数。梯度稀释质粒制备标准品,建立PEDV标准曲线且线性关系良好,R2=0.997,建立PEDV-M荧光定量PCR方法,并通过优化条件,确定反应程序和体系。敏感性实验可检测到3.168copies/μL的模板cDNA.特异性实验中TGEV、PRV、PRRSV、HEV阴性对照均为阴性,阳性样则出现目的条带。重复性试验中,批内重复和批间重复其变异系数都小于2%。临床样品检测结果阳性率达98%。PEDV抗体检测的IFA方法：将适应于PEDV体外培养的LR7细胞铺于24孔板,24h后,按MOI=0.1铺上病毒,于37℃病毒吸附lh,弃去病毒液,24-36h后加入一抗和二抗,并设阴性血清对照、无一抗的病毒对照和正常细胞对照,荧光显微镜下观察。以建立免疫荧光方法。结果：可在显微镜下观察到特异的荧光,且阴性血清对照、无一抗的病毒对照和正常细胞对照均无特异性荧光出现。PEDV抗体检测的相对定量中和试验方法：将不同稀释度的阳性血清与插入GFP发光基团的PEDV病毒37℃中和30min,铺于长满VERO细胞的24孔板,12h后荧光显微镜下观察,用细胞裂解液将细胞裂解下来后用TBS-380微型荧光计测的荧光值,建立线性关系,建立微量中和实验相对定量血清抗体的方法。结果：病毒与血清中和12h后于显微镜下观察有很好的荧光梯度,测得各血清的荧光值可看出较好的抗体水平高低。说明本实验建立的中和实验相对定量血清抗体的方法是可靠的。