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多管水母的发光系统由光蛋白—多管水母素（aequorin）和绿色荧光蛋白（GFP）组成。GFP作为良好的活体标记，而aequorin作为分子标记及Ca2+的生物学指示剂，已被广泛地应用于生命科学的多个研究领域。迄今所研究的GFP和aequorin主要来源于维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria）。本研究从中国厦门水域的多管水母中获得gfp和aequorin基因，并进行原核、真核表达，系统检测其荧光和其他理化性质，同时通过对gfp基因的定向突变和一定区域的随机突变，获得一些具有独特荧光或理化性质的变异型。 本研究采用PCR扩增和Southern杂交相结合的方法，分别从厦门海域的大型多管水母（Aequorea macrodactyla）和细小多管水母（A.parva）中分离到了新的光蛋白基因aeqxm和aeqxxm，并在大肠杆菌中进行了表达。aeqxm与aeqxxm DNA序列的编码区总长均为585bp，无内含子，推导的氨基酸序列总长均为195个氨基酸。aeqxm、aeqxxm DNA与AEVAQ440x cDNA之间的核苷酸序列同源性分别为80.7％、85.1％，aeqxm和aeqxxm DNA的核苷酸序列同源性为87.2％。Apoaeqxm、apoaeqxxm与AEVAQ440x编码的氨基酸序列之间的同源性分别为84.7％、84.2％，apoaeqxm和apoaeqxxm的氨基酸序列之间的同源性为94.4％。分别将aeqxm和aeqxxm基因克隆至pTO-T7表达载体，apoaeqxm、apoaeqxxm在大肠杆菌中的表达量都达到40％左右。取菌体超声上清与coelenterate f、2-mercaptoethanol混合再生后，加入CaCl2，用荧光全谱仪检测到470nm处的瞬时发光，表明表达的apoaeqxm、apoaeqxxm具有正常的生物学功能。本文还探讨了再生时间、NaCl浓度、pH和温度对Aeqxm、Aeqxxm再生的影响。 采用相同的方法，从厦门水域的大型多管水母中分离到了新的绿色荧光蛋白基因gfpxm，并在大肠杆菌中进行了表达。gfpxm DNA序列编码区长为1042bp，包含3个外显子和2个内含子，cDNA编码区全长为717bp。gfpxm cDNA与已知野生型Aeqgfp10 cDNA长度一致，核苷酸同源性为81.9％，推导的氨基酸序列全长为238个氨基酸，与AeqGFP10的氨基酸同源性为83.6％。将gfpxm克隆至pTO-T7表达载体，GFPxm在大肠杆菌BL21中的表达量达菌体总蛋白的50％左右。荧光性质和强度分析结果表明，GFPxm蛋白的激发峰为476nm，发射峰为496nm，荧光量子产率为1。GFPxm 摘 要 蛋白的荧光很稳定，对热、碱性、变性剂和盐等有较强抗性。 GFPxm只能在低温下成熟的缺点限制了它的应用。本研究进一步采用定 点突变、DNA shuffl lug等方法对 GFPxm进行基困突变，共获得T GFPxm 的12种突变型。 其中突变型GFPxM、GFPxm19在37C高温表达产生明亮的绿色荧光， 而两个氨基酸的替换只引起激发和发射峰的微小移动。另有三种突变型 GFPxm16、ShG24和GFPxm161 64激发峰红移至485－500urn，发射峰红移至 506—510urn。 本研究还获得了三种光谱进一步红移的突变型GFPxml 62、GFPxm163和 OFPxm。由 GFPxm16的T203F突变得到的GFPxm162达到了目前的最长发射 峰525urn。在GFPxml6和ShG24的第 203位氨基酸处进行同样的 T293Y突变， 得到的两个突变株GFPxm163和OFPxm具有相似的光谱。GFPxm163的激发峰 为 512urn、发射峰为 523urn，产生黄绿色荧光，OFPxm的激发峰为 509urn、 发射峰为 523urn，产生的却是橙色荧光。GFPxm163的荧光强度是所有突变 型中最高的，而 OFPXfll的荧光强度相对较低。 此外定点突变还获得了三种具有两个激发峰的突变型GFPX。191tJV、 0呷xml guy和盯Pxml幻uv。叮P－cull91uv在叩8nl有一个激发王峰，是394urn 激发肩峰的 3倍高，它的发射峰为 510urn。GFPxm19uv的激发主峰为 393urn， 是次峰 476urn 白两倍，发射峰为 505urn。GFPxm181uv6激发主峰为 398urn， 大子次峰 500urn的两倍，发射峰为 514urn。定点突变还获得了一株具有单一 紫外激发峰的突变型GFPxnllsuv，其激发峰为400urn，发射峰为sl3nm。 在所有的突变型中，除T GFPxml61、GFPxm181uv和 GFPxm18uv外，其 余突变型在高温下都能有效而快速地成熟并且产生很高的荧光强度。将其 中的六种GFPxm突变型基因克隆至真核表达载体，并转染三种哺乳动物细 胞CHO、He la和HepGZ，结果表明有四种突变型一GFPxm16、GPPxm18、GFPxm19 和 GFPxml6 3在三种哺乳动物细胞中获得良好的表达。