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脯氨酸氨肽酶具相对严格的底物特异性，能特异地水解多肽或蛋白N-端的脯氨酸残基。作为氨肽酶系列中的一种，脯氨酸氨肽酶除可用于蛋白类食品水解加工产物中苦味的去除，还在胶原蛋白水解应用方面有较好的应用前景。本论文以米曲霉JN-412（Aspergillus oryzae JN-412，CGMCC8474）总RNA为模板，试剂盒合成双链cDNA，特异性引物扩增得到编码脯氨酸氨肽酶的cDNA序列，成功构建了产脯氨酸氨肽酶的重组大肠杆菌BL21/pap，并获得大量可溶性的活性蛋白。通过Ni2+-NAT亲和层析一步纯化获得了电泳纯的重组脯氨酸氨肽酶，纯化倍数和回收率分别为3.3和36.7%。对重组酶酶学性质研究发现，该氨肽酶的最适温度和pH值分别为60oC和7.5。该氨肽酶具有较好的pH稳定性，分别在pH5.0-11.0的缓冲体系中30oC保温1h，残留活性在80%以上。对于该酶的热稳定性，在50oC保温1h残留酶活仅有10%。Zn2+、Cu2+和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对该氨肽酶有强烈的抑制作用，还原剂（DTT、-巯基乙醇）和金属离子螯合剂EDTA对该酶没有影响，Zn2+和-巯基乙醇共同存在，Zn2+的抑制作用被削弱。该氨肽酶与中性蛋白酶复配应用于胶原蛋白的水解，分析各实验组水解液中氨基酸组成的变化发现：与三组对照组相比，利用中性蛋白酶和脯氨酸氨肽酶复合水解的水解液中氨基酸量明显增加。通过优化得到摇瓶阶段的最佳产酶条件：葡萄糖5g·L-1；蛋白胨20g·L-1；酵母膏30g·L-1；Mg2+7.5mmol·L-1；K2HPO412.54g·L-1；KH2PO42.31g·L-1，初始pH7.2，对数期种子2%，装液量50mL/250mL，最佳诱导时机为接种后9h（OD600≈11.44），诱导时乳糖终浓度3g·L-1，诱导时间为12h，最终酶活力达到了78.42U·mg-1，菌体干重（DCW）为4.55g·L-1（OD600≈13.67）。在7L发酵罐上分别进行了分批和补料分批发酵实验，对产脯氨酸氨肽酶重组大肠杆菌的高密度培养（HCDC）进行了摸索，发现指数流加补料策略有效地控制了菌体生长过程中乙酸的积聚，OD600是分批发酵的9.16倍，达到了142（DCW=44.96g·L-1）。酶活力达到了211.20U·mg-1，是分批发酵的2.3倍。利用分子动力学模拟确定脯氨酸氨肽酶中柔性较大的区段（238-246），该区段远离脯氨酸氨肽酶的催化中心，序列分析发现该区段中发现存在柔性氨基酸Gly241，通过Discovery studio2.5中Build Mutants模块构建G241P突变体，对该突变体进行分子动力学模拟发现，通过将该位点突变为刚性氨基酸Pro后，该区段柔性下降，构象趋于稳定。将突变体的基因在大肠杆菌中进行表达，纯化后测定突变体的热稳定性，结果发现突变体T50比原始酶提高了4.8oC。