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普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)G3分离自小麦内茎,是一种能产生几丁质酶、蛋白酶和硝吡咯菌素(PRN)等多种抗真菌因子的内生细菌。Hfq是细菌中相对保守的RNA结合蛋白,主要在转录后水平上全局调控细菌基因的表达。在革兰氏阴性细菌中,群体感应系统主要由LuxI／R同源物组成,通过分泌扩散性小分子信号酰基高丝氨酸内酯(AHLs),以种群密度依赖的方式在转录水平全局调控基因表达,调节细菌生理和行为以适应不断变化的环境。
本研究以S.plymuthica G3为模式细菌,一方面在已获得的hfq基因突变体的基础上,采用基于lux-或lacZ-报告基因融合的策略和TLC等检测方法,分析了Hfq对PRN和IAA生物合成的影响,以及自我调控；另一方面通过构建突变体和互补菌株分析等策略,初步鉴定了S.plymuthica G3菌株的第三个群体感应系统及其调控的生防相关表型。
主要结论如下:
1.hfq的功能分析:
(1)基于G3／prnA∷lux和△hfq／prnA∷lux的转录融合分析发现,△hfq／prnA∷lux的生物发光明显低于G3／prnA∷lux,表明Hfq对prnA在转录有一定的影响；同时基于G3／prnA∷lacZ和△hfq／prnA∷lacZ的翻译融合分析,与野生菌比较,△hfq／prnA∷lacZ菌株的β-半乳糖甘酶活性处于很低的水平。与转录水平比较,转录后水平的调控作用更为明显。
(2)基于TLC分析G3和△hfq菌株中硝吡咯菌素的提取物,证实了prnABCD操纵子的表达是Hfq依赖的；与野生菌G3相比,△hfq突变株几乎丧失了产生PRN的能力,通过TLC分析在不可检测水平。
(3)构建了G3／rpos∷lacZ、△hfq／rpos∷lacZ菌株,通过β-半乳糖甘酶活性分析发现△hfq／rpos∷lacZ的半乳糖甘酶活性明显低于野生菌株,表明Hfq也是可变σ因子RpoS翻译所必需的。
(4)通过比较分析G3和△hfq菌株产生的吲哚乙酸(IAA),发现Hfq还正向调控IAA的产生。
(5)通过构建G3／hfq∷lacZ和△hfq／hfq∷lacZ菌株,发现Hfq还是一个正向自我调控子,与大肠杆菌E.coli中Hfq作为自我翻译的抑制子不同。
(6)分析蛋白质组学分析对数期G3租△hfq菌株的全细胞蛋白表达谱,共发现194个差异点,经质谱鉴定了110个差异蛋白:以野生型作为对照,其中表达下调点有80个,上调点有30个。其中57个是与参与细胞代谢相关的蛋白,26个参与细胞加工和信号转导有关,18个参与信息储藏与修饰的蛋白有关。
2.通过生物信息学分析和PCR扩增,克隆了菌株G3中第3个群体感应系统SptI／R。进一步经突变和功能分析,初步鉴定SptR是一个正调控子。
以上结果说明Hfq和SptR作为S.plymuthica内生菌株G3的2个全局调控子可在转录后和转录水平上影响细菌多种生理活动,并与生防能力和植物生长促进水平密切相关,作为遗传操纵的靶标展示出巨大的潜能,可用于构建工程菌株改良生防效率和稳定性,为优化生防微生物接种体提供新策略。