新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是由于新生儿窒息，引起脑血供和气体交换障碍所致的一种全脑性损伤，是严重危害新生儿生命健康的疾病，有较高的发病率和死亡率，也是造成儿童智能低下、脑瘫等神经系统残疾的重要原因之一。HIBD的发病原因及发病机制较为复杂，越来越多的证据表明，细胞凋亡(Apoptosis)也参与HIBD，并在其中发挥独特的作用。神经元细胞凋亡的发生与患儿的预后有着密切的联系。在分子水平上，细胞凋亡过程受到多种基因及细胞因子的调控，Bcl-2家族是研究的热点，其中Bax和Bcl-2的相对比值在细胞凋亡中起着重要作用；本实验通过建立新生鼠缺氧缺血性脑损伤模型，对损伤后的各组动物进行针刺、温和灸、针刺结合温和灸后，利用HE染色和免疫组织化学手段观察脑组织中凋亡细胞及其细胞调控因子的动态表达规律，探讨新生鼠缺氧缺血性脑损伤神经元凋亡的形态学动态变化、凋亡调控蛋白动态表达规律，为针灸对新生儿缺氧缺血性脑损伤神经元凋亡及调控蛋白的影响机制研究提供动物实验依据。为推广早期针灸改善新生儿学习记忆能力、提高针灸临床疗效提供实验依据。　　（一）目的:　　通过观察针灸HIBD模型幼鼠行为学、学习记忆能力的改变和脑细胞凋亡及相关基因表达的影响，研究针灸对HIBD模型幼鼠治疗作用，为小儿脑瘫早期介入提供实验依据。　　（二）方法:　　本实验分为两部分，首先模拟围产期窒息建立HIBD模型，利用悬吊试验、斜坡试验、Y迷宫试验来测试受干预后HIBD模型鼠的学习记忆能力并从细胞水平上观察HIBD模型鼠海马组织正常神经细胞计数及脑皮质组织细胞凋亡情况；随后利用免疫组织化学方法观察HIDB模型幼鼠凋亡调控蛋白动态表达规律来探讨针灸是否可以对抗此效应，以探讨HIBD学习记忆障碍的可能机理和针灸改善HIBD学习记忆障碍的机制。　　将动物随机分成①正常组②假手术组③模型组④单纯针刺组⑤温和灸组⑥针刺+温和灸组，制定了治疗的时间表后穴位定位参照《实验针灸学》，结合人与动物骨度类比：顶骨正中定百会；外耳道口直上0.8cm处模拟颞Ⅰ针；桡骨近端的关节外侧，离腕关节约3mm左右的尺桡骨缝间取内关；曲池，桡骨近端的关节外侧前方的凹陷中；足三里(即后三里)，在膝关节后外侧，腓骨小头下约5mm处；后肢掌心前正中取涌泉穴进行诊疗，治疗两个阶段后，分别进行 HIBD模型幼鼠的行为运动能力及学习记忆能力测试，然后处死取材，分别检测模型幼鼠的脑细胞病理形态、凋亡及相关的基因表达指标。　　（三）结果:　　1.体重指标：多重比较结果显示：①正常组，②假手术组，⑤艾灸组，⑥针刺+艾灸组这四组之间均数无统计学差异，③模型组与④单纯针刺组之间也无统计学差异。而前四组与后两组相比，P=0.000<0.01,体重增加都有统计学意义，可以认为前四组比后两组体重增加更多。区组间F=16.670，P=0.149>0.05，可认为区组因素没有统计学意义。以上结果说明：与模型组相比，灸组、针刺+艾灸组对HIBD幼鼠的体重增加有促进作用，它们两者之间没差异，使其体重增加速度和幅度与正常和假手术幼鼠相当。单纯针刺在这次实验中没发现有作用，原因需进一步研究。　　2.悬吊试验、斜坡试验及Y迷宫试验结。肌力(悬吊试验),②假手术组>①正常组>⑥针刺+温和灸组>⑤温和灸组>③模型组>④单纯针刺组；平衡能力（斜坡试验）①正常组>②假手术组>⑥针刺+温和灸组>⑤温和灸组>④单纯针刺组>③模型组。因素 time和处理方法的交互作用方面，肌力(悬吊试验)增长趋势：②假手术组>①正常组>⑥针刺+温和灸组>⑤温和灸组>③模型组>④单纯针刺组；平衡能力（斜坡试验）增长趋势：①正常组>②假手术组>⑥针刺+温和灸组>④单纯针刺组>⑤温和灸>③模型组。以上结果说明：与模型组相比，艾灸对 HIBD模型幼鼠的肌力和平衡能力增长得更好，而针刺结合温和灸后效果更佳；同样的，与模型组相比，温和灸对 HIBD幼鼠的肌力和平衡能力的增长有更好的促进作用，而针刺结合温和灸后效果更佳；但都比不上正常组和假手术组。针刺结果不稳定，原因需进一步研究。Y迷宫实验结果显示：不同处理组间，F=2.3753，P=0.000<0.01。不同窝别间，F=40.404，P=0.000<0.01。可以认为不同处理组间的 Y迷宫正确次数不完全相等。多重比较结果显示：①正常组>②假手术组>⑥针刺+温和灸组>⑤温和灸组>④单纯针刺组>③模型组。说明在智力和记忆力方面，针刺、温和灸对HIBD模型幼鼠都有促进作用，而两者结合后效果最佳。　　3.脑组织病理形态学观察及细胞数　　（1）海马HE染色观察：普通光镜10320倍下随机观察每张切片5个视野内脑缺血缺氧后病理变化情况。各组实验大鼠脑组织病理形态学改变：脑组织常规石蜡切片， HE染色后，神经细胞胞浆呈淡红色，核呈蓝黑色。正常对照组及假手术组皮层脑细胞结构正常，胞核清晰，胞浆丰富，间质无水肿表现，海马锥体细胞2～3层，排列紧密，细胞核圆而大，核仁清晰。模型组可见皮层变薄，部分神经元变性，体积变小，胞核与胞浆界限模糊，核固缩成三角形或不规则形，核仁消失。海马锥体细胞层数减少，排列稀疏、不规则，细胞体积变小，可见核固缩现象。针刺组、温和灸组及针刺结合温和灸治疗组仍有不同程度的神经细胞变性，但变性神经细胞数量显著减少，零星可见一些损伤细胞，海马锥体细胞层细胞形态、排列基本正常。　　（2）各组幼鼠脑皮质正常神经细胞数目的比较结果示：假手术组与正常对照组比较（P＞0.05）差距无统计学意义；假手术组与模型组对照（P＜0.01），差距有显著的统计学意义；治疗组与模型组对照差距（P<0.05）有统计学意义，且针刺结合艾温和灸组在所有的治疗组中的效果更优。结果表明，针刺、温和灸、针刺结合温和灸对HIBD模型幼鼠的治疗效果均有统计学意义。且针刺结合温和灸组疗效更优。　　（3）实验各组脑皮质组织细胞凋亡数比较结果示：假手术组与正常对照组比较（P＞0.05）差距无统计学意义；假手术组与模型组对照（P＜0.001），差距有极显著的统计学意义；治疗组与模型组对照差距（P<0.01）有显著统计学意义，且针刺结合温和灸组在多有的治疗组中的效果更明显。结果表明，针刺、温和灸、针刺结合温和灸对HIBD模型幼鼠的治疗效果均有统计学意义。且针刺结合温和灸组疗效更优。　　4.脑细胞超微结构　　正常组：神经元胞核大而圆，双层核膜有清晰的核周隙，其宽度均匀而明显；胞质内有较多核糖体、内质网、高尔基氏体和线粒体；线粒体呈圆或卵圆形，嵴较多而明显。　　假手术组：神经细胞胞体基本完整，细胞核呈圆形或卵圆形，膜结构完整、规则，核周间隙均匀，核内染色质分布均匀，偶见异染色质；胞质内细胞器丰富，可见高尔基体呈扁平囊泡平行排列；线粒体增多，呈圆形、椭圆形，基质均匀，偶有空泡；内质网核糖体丰富。　　模型组：神经细胞核膜模糊，多呈不规则形状，核内异染色质增多、电子密度增高，核膜及核周隙模糊不清，局部核质分界不清；核仁呈均一电子密度，网状结构消失；细胞器减少或变形，结构不清；线粒体呈气球样肿胀，粗面内质网几乎见不到；质膜结构不清或消失断裂。　　针刺组：神经细胞核膜尚规则，核内染色质仍有凝集，胞质内可见大量线粒体，形态基本正常，偶有肿胀，空化；胞质内可见粗面内质网、高尔基体有空泡样改变，分布散乱。　　温和灸组：神经细胞核膜尚规则，胞质内常染色质均匀，偶见异染色质，胞质内可见大量线粒体，形态基本正常，偶有肿胀、空化；胞质内可见粗面内质网、高尔基体有空泡样改变，分布散乱。　　针灸结合组：神经细胞核膜尚规则，胞质内常染色质丰富，可见大量线粒体，基质较均匀，偶有肿胀；胞质内粗面内质网、高尔基体囊腔少数略有扩张。　　5.实验各组幼鼠大脑皮质bcl-2、bax蛋白表达　　（1）各组幼鼠大脑皮质 bcl-2蛋白表达的比较结果示：假手术组与正常对照组比较（P＞0.05）差距无统计学意义；假手术组与模型组对照（P＜0.05），差距有统计学意义；治疗组与模型组对照（P<0.05）差距有统计学意义，且针刺结温和灸组在所有的治疗组中的效果更明显。结果表明，针刺、温和灸、针刺结合温和灸对HIBD模型幼鼠的治疗效果均有统计学意义。且针刺结合温和灸组疗效更优。　　（2）各组实验幼鼠大脑皮质 bax蛋白表达的比较结果示：假手术组与正常对照组比较（P＞0.05）差距无统计学意义；假手术组与模型组对照（P＜0.05），差距有统计学意义；治疗组与模型组对照（P<0.05）差距有统计学意义，且针刺结合温和灸组在多有的治疗组中的效果更明显。结果表明，针刺、温和灸、针刺结合温和灸对HIBD模型幼鼠的治疗效果均有统计学意义。且针刺结合温和灸组疗效更优。　　（四）结论:　　1.从实验一结果看，假手术组、模型组及治疗组都有不同程度的细胞凋亡，从细胞超微结构的结果来观察，干预组对 HIBD脑组织细胞都有保护的治疗效应，且除了能减轻神经元损伤外，更重要的是应该能改善脑细胞凋亡造成的远期功能改变。　　2.本实验选用百会、颞1针、内关、曲池、足三里、涌泉给予针刺激并温和灸幼鼠的头顶区，发现慢性应激大鼠的空间学习和记忆能力明显提高。同时可明显减轻缺血缺氧对神经元和神经胶质细胞超微结构的损害程度。　　3.本实验二通过对 HIBD模型幼鼠在同一基线特征的基础上随机分配成四组，分别是：模型组、针刺组、针刺结合温和灸组和温和灸组，并设立了假手术组和正常对照组。在针刺、温和灸、针灸结合温和灸干预下，结果发现：Bcl-2蛋白表达增加，Bax蛋白表达增下降，细胞凋亡发生过程得到控制。且针刺结合温和灸的效果更优，　　4.从实验的结果看，灸法对HIBD模型幼鼠早期介入的疗效值得肯定，这对脑瘫患儿早期治疗提供了一个简便易行的独特疗法打下基础，值得推广和应用。因细胞凋亡主要发生在缺氧缺血相对较早的时期，如果在达到凋亡高峰后仍不能得到足够的血液灌注或抑制凋亡措施的干预，其结果造成局部脑组织进一步发展为坏死，若能得到及时有效的治疗，就有可能阻断、甚至逆转细胞凋亡，从而挽救神经元。　　5.在缺氧缺血神经元凋亡的过程中，存在着若干神经元保护的机制，如果这些机制能早期在积极而有效的各种适当的干预下，则有可能可使细胞凋亡的进程得到控制，甚至重新建立新的细胞生长机制。