家蚕TINP1的表达分析及其亚细胞定位

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我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中获得一条cDNA序列,比对后发现该序列可以编码家蚕转化生长因子β诱导的核蛋白(Bomby.mor.TGF-beta-inducibl.nuclea.protei.1,BmTINP1)。序列分析发现BmTINP1与无脊椎动物中该蛋白的氨基酸序列同源性较高(达90%)。该基因序列长为78.bp,编码259个氨基酸,预测分子量为30.0.kDa。将该基因的ORF克隆到载体pET-28a中,成功构建原核表达质粒pET-28a-B.TINP1,并转化感受态细胞E.col.BL21(DE3),经IPTG诱导表达后SDS-PAGE检测,与阴性对照相比在3.kDa处有一特异性条带,与预期值相符。融合蛋白以不溶性的包涵体形式存在。超声波裂解菌体分离包涵体并离心、洗涤,对包涵体进行溶解,采用亲和层析的方法纯化融合蛋白。经FPLC反相柱层析进一步纯化后,再进行质谱分析,得到该融合蛋白的分子量为33620 Da(融合标签3.5.kDa,BmTINP.30.0.kDa),进一步证实了该蛋白表达的正确性。以纯化所得蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔,制备了该重组蛋白的多克隆抗体,并用Protei.A凝胶柱纯化多克隆抗体。ELISA检测该抗血清的效价可达到1:25600以上。通过Wester.blot分析,发现BmTINP1在家蚕五龄幼虫的头部表达量最高,卵巢次之,气管最低。实时定量PCR的结果表明,家蚕BmTINP.mRNA在家蚕的各个发育时期和各个组织中广泛分布:以五龄幼虫中的转录量最高,蛾的转录量最低;在五龄幼虫的卵巢中的含量最高,丝腺次之,气管最少。通过免疫荧光法分析了BmTINP1的亚细胞定位,BmTINP1既存在于细胞质中,也存在于细胞核中。
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