目的:1.从眼科角度探讨糖尿病视网膜病变不同分期与糖尿病肾病不同分期患者的临床分期相关性。2.通过建立糖尿病大鼠模型,探讨糖尿病视网膜病变及肾组织发生病变的机制。3.基于AMPK通路观察中药对糖尿病大鼠视网膜和肾脏组织病变的干预作用,并探讨其作用机制。方法:1.临床研究方法对2017年1月至2018年12月期间曾在中国中医科学院眼科医院消渴目病科住院的2型糖尿病伴有糖尿病视网膜病变患者进行研究。共纳入相关临床资料、实验室指标、辅助检查完整的患者230例,其中男性129例,女性101例。根据糖尿病视网膜病变(DR)诊断分期标准将入组患者分为Ⅰ-Ⅵ期,其中Ⅰ-Ⅲ期为非增殖性糖尿病视网膜病变组(BDR组),Ⅳ-Ⅵ期为增殖性糖尿病视网膜病变组(PDR组);根据糖尿病肾病(DKD)的临床诊断标准将入组患者分为无糖尿病肾病组(NK组)和有糖尿病肾病组(DKD组),进一步根据CKD临床分期将DKD组分为1-2期(K1组),3-5期(K2组)。研究DR分期与肾病分期、临床一般资料、血糖血脂等指标的相关性。2.实验研究方法选购6周龄SPF级雄性SD大鼠,随机选取10只作为正常组,其余40只腹腔注射2%链脲佐菌素(STZ)55mg/kg诱导糖尿病大鼠模型。将造模成功后的大鼠随机分为对照组,试验组(高、中、低剂量组),用柴归汤加减方对大鼠进行灌胃,周期为24周。期间动态观察各组大鼠的一般状态,每4周1次监测大鼠体重、随机血糖。灌胃24周后处死大鼠,取出视网膜与肾组织,制作石蜡切片通过HE染色与免疫组织化学染色观察视网膜及肾组织的病理形态学改变与自噬情况,RT-PCR测定视网膜及肾组织中AMPK、Beclin-1、LC3的表达情况。结果:1.临床结果1)BDR组104例,PDR组126例,其中BDR组中男55例,女49例,PDR组中男74例,女52例,性别在两组之间的分布无统计学差异(P=0.374);年龄、DM发病年龄、肌酐、尿微量白蛋白、尿免疫球蛋白G、α1微球蛋白、尿转铁蛋白在两组之间存在统计学差异(P<0.01);高血压病程在两组之间存在统计学意义(P<0.05)。提示年龄,尤其是DM发病年龄与DR分期具有相关性,DM发病年龄越早、年龄越小DR程度越严重。PDR组中高血压病程较短。肾功能相关指标与DR分期具有相关性,PDR组肾功能更差。2)230例糖尿病视网膜病变患者中BDR组(Ⅰ-Ⅲ期)中NK组99例(95.2%),K1 组 4 例(3.8%),K2 组 1 例(1.0%);PDR 组(Ⅳ-Ⅵ 期)中 NK 组 107例(84.9%),K1 组 14 例(11.1%),K2 组 5 例(4.0%)。BDR 组与 PDR 组之间是否合并糖尿病肾病具有统计学意义(P<0.05)。DR分期(Ⅰ-Ⅵ期)与DKD分组之间Spearman相关系数=0.168,P=0.011;Kendall分析相关系数=0.944,P=0.000<0.01。因此,可以认为DR与DKD分期之间具有相关性。提示DR分期与DKD分期具有正相关性,PDR组肾脏病变程度明显加重。但是有糖尿病视网膜病变者不一定都合并糖尿病肾病。3)DR分期与年龄、DM发病年龄、高血压病程呈负相关,相关系数r分别为-0.279,-0.253,-0.133,其中年龄、DM发病年龄的P<0.01,高血压病程的P<0.05。提示年龄、DM发病年龄偏小,高血压病程较短的患者DR分期增加。4)DR分期与血β 2-MG和尿素氮之间不具有相关性;DR分期与尿蛋白、尿微量白蛋白、尿免疫球蛋白G、α1微球蛋白、尿转铁蛋白和肌酐呈正相关,相关系数分别为 0.215,0.295,0.262,0.206,0.270,0.204,P 均小于 0.01。说明随DR分期的发展尿蛋白、尿微量白蛋白四项、肌酐也在变化,呈升高趋势。2.实验结果1)体重、血糖:不同时间点之间(4w、8w、12w、16w、20w、24w)大鼠体重存在显著差异(P<0.01)。组内比较发现,4w后正常组大鼠与模型组之间体重存在显著差异(P<0.01)。24w时,中剂量组优势显现,与模型组之间存在显著差异(P<0.01)。与正常组相比,模型组大鼠血糖明显增加。对比灌胃组大鼠血糖控制情况,可以看到中剂量组在4w-12w血糖控制效果最佳。2)HE染色与正常组相比,模型组大鼠肾小球基底膜略微增厚、弥漫性系膜基质增宽,纤维化严重,毛细血管壁明显增厚;肾小囊增大,肾小管局灶扩张伴上皮细胞空泡样改变;肾间质明显纤维化并伴炎性细胞浸润。视网膜明显变薄,细胞排列紊乱;神经节细胞数量明显减少,体积明显缩小,毛细血管有扩张,管腔增粗,有空泡形成;神经纤维层、内丛状层的毛细血管有扩张,腔内有红细胞;内界膜、神经纤维层组织有水肿,网状结构变得疏松,感光细胞层排列疏松,色素上皮层中毛细血管管腔明显扩张,腔内有红细胞,且部分红细胞渗漏到血管以外的组织中。证实DM大鼠肾组织及视网膜的病变。3)免疫组织化学结果肾组织:与正常组相比,模型组肾组织AMPK、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达受到抑制,阳性表达细胞减少,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,高、中、低剂量组肾组织AMPK、Beclin-1、LC3-Ⅱ水平升高,具有统计学差异(P<0.05);与中剂量组相比,模型组、高剂量组、低剂量组肾组织AMPK降低,且存在统计学差异(P<0.05);肾组织Beclin-1、LC3-Ⅱ与中剂量组相比,模型组蛋白表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。提示高糖状态下大鼠肾组织AMPK、Beclin-1、LC3-Ⅱ表达被抑制,柴归汤加减方可能通过激活肾组织AMPK,使自噬表达增加,改善高糖状态下大鼠肾组织病变程度。视网膜:与正常组相比,模型组视网膜AMPK、Beclin-1、LC3-Ⅱ活性受到抑制,阳性表达细胞减少,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,高、中、低剂量组视网膜AMPK、Beclin-1、LC3-Ⅱ水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与中剂量组相比,模型组视网膜AMPK、Beclin-1、LC3-Ⅱ水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与中剂量组相比,低剂量组视网膜LC3-Ⅱ水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。提示柴归汤加减方可能通过激活视网膜AMPK,使灌胃组自噬表达增加,从而改善高糖状态下大鼠视网膜病变程度。相关性:AMPK、Beclin-1、LC3-Ⅱ指标在视网膜与肾组织表达的AO值存在显著相关性(P<0.01),相关系数r分别为0.782,0.872,0.782。提示AMPK、Beclin-1、LC3-Ⅱ指标在视网膜与肾组织中的表达呈正相关关系。4)PCR结果肾组织:与正常组相比,模型组AMPK、Beclin-1、LC3-Ⅱ的mRNA表达均偏低,且均具有统计学差异(P<0.05);②与模型组相比,灌胃组AMPK、Beclin-1、LC3-Ⅱ的mRNA表达均升高,且均具有统计学差异(P<0.05);③与中剂量组相比,模型组、低剂量组AMPK、LC3-Ⅱ的mRNA表达均下降,且具有统计学差异(P<0.05);④与中剂量组相比,模型组Beclin-1的mRNA表达下降明显,且具有统计学差异(P<0.05)。提示模型组大鼠肾组织AMPK、Beclin-1、LC3-Ⅱ mRNA相对表达量被抑制,柴归汤加减方可能通过增加肾组织AMPK mRNA相对表达量使自噬表达增加,进而减轻糖尿病大鼠肾组织病变程度。视网膜:与正常组相比,模型组AMPK、Beclin-1、LC3-Ⅱ的mRNA表达均偏低,且均具有统计学差异(P<0.05);②与模型组相比,灌胃组AMPK、Beclin-1、LC3-Ⅱ的mRNA表达均升高,且均具有统计学差异(P<0.05);③与中剂量相比,AMPK、LC3-Ⅱ的mRNA表达模型组、低剂量组降低,且具有统计学差异(P<0.05);④与中剂量相比,Beclin-1的mRNA表达模型组、高剂量组、低剂量组降低,且具有统计学差异(P<0.05)。提示高糖状态下大鼠视网膜AMPK、Beclin-1、LC3-Ⅱ mRNA相对表达量相对正常大鼠mRNA相对表达量被抑制,柴归汤加减方可增加AMPK mRNA相对表达,从而改善高糖状态下大鼠视网膜病变程度,且其可能机制是自噬。结论:1.糖尿病视网膜病变分期与糖尿病肾病分期之间呈正相关。增殖期糖尿病视网膜病变患者中糖尿病肾病在所占比例显著升高,且肾病程度更加严重。但是并非所有糖尿病视网膜病变患者都合并糖尿病肾病。2.糖尿病视网膜病变分期与尿蛋白、尿微量白蛋白、尿免疫球蛋白G、α1微球蛋白、尿转铁蛋白和肌酐呈正相关,与年龄、DM发病年龄呈负相关,因此糖尿病发病年龄越早,视网膜病变越严重的患者,肾功能的各项指标也越严重。3.AMPK、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白在模型组大鼠视网膜及肾脏组织中表达水平降低,柴归汤加减方能通过增加肾组织及视网膜中AMPK的表达调节自噬,从而改善DM大鼠视网膜和肾组织病理结构。