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第一部分Smg1 konckdown导致Upf1和Upf2表达的升高 背景及目的 mRNA的降解是基因表达过程中一个很重要的调控方式。目前已知真核细胞mRNA的降解有三种途径,其中无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay, NMD）是近年发现的一种在真核生物中广泛存在的高度保守的RNA监控（RNA surveillance）机制。NMD能够选择性地降解含有提前终止翻译密码子（premature termination condon, PTC,又称无义密码子）的mRNA,从而阻止异常的截短蛋白（truncated protein）的产生。这种截短蛋白不仅不具有正常的生理功能,而且能与正常蛋白发生竞争,从而影响细胞的正常生理功能。 NMD途径需要有剪接、翻译、磷酸化过程以及特异蛋白质组分的参与。作为剪接的结果,在mRNA的外显子-外显子连接（exon-exon junction,EEJ）的上游20-24个核苷酸处装配有外显子连接复合物（exon junction complex,EJC）,对于NMD是必需的。Upf（up-frameshift mutant）是目前研究较多的NMD反式作用因子,包括Upf1、Upf2和Upf3。当前体mRNA发生剪接后,EJC与核浆穿梭蛋白upf3和TAP结合,介导mRNA出核。出核后,Upf2通过与Upf3结合而补充到mRNA上,mRNA与核糖体结合并开始翻译。正常情况下,核糖体会沿着mRNA滑动将所有EJC清除,直至遇到正常终止密码子后终止翻译。如果核糖体在距EJC上游＞50-55 nt处遇到PTC,翻译将提前终止,由Smg1、Upf1、eRF等组成的SURF（SMG1-Upf1-eRF）复合物与Upf2结合,最终导致mRNA的脱帽和降解。 Smg1是NMD组分中一个很重要的因子,它作为一个PI-3激酶,与另一NMD组分Upf1相结合并对其进行磷酸化,同时形成SURF复合物。后者与Upf2结合并最终导致无义mRNA的降解。Smg1和Upf1不仅作为NMD的重要组分,而且还参与DNA代谢过程。有研究报道,抑制Upf1基因的表达可以导致S早期捕获和DNA损伤反应。Smg1也被报道参与细胞周期的运行和DNA损伤的关键步骤。这些报道说明NMD组分通过多途径参与基因信息稳定性的维持。然而,目前对NMD各组分的定量调节机制还所知甚少。 方法 为了探讨Smg1对Upf1及Upf2含量的影响,本研究用RNAi方法使Hela细胞Smg1 knockdown,然后利用western blot观察其对Upf1和Upf2的蛋白表达的影响,用免疫荧光观察Upf1和Upf2在细胞中的定位及其荧光强度的变化,用realtime-PCR方法观察其对Upf1和Upf2的mRNA水平的影响;并利用不同的细胞系和不同序列的RNAi片段,对实验结果加以证实。 结果 （1） Western blotting结果显示,和Luciferase SiRNA转染的细胞相比,用SMG1 5032 SiRNA转染的Hela细胞中,Smg1的蛋白含量明显降低,说明Smg1被成功地knockdown,基因受到抑制; （2）在Smg1 5032、2999、5202几种SiRNA转染的细胞中,Upf1和Upf2的蛋白表达明显增高,说明Smg1 knockdown能够导致Upf1和Upf2蛋白的表达增加。 （3） Smg1 SiRNA同样能够导致A549和HE-4细胞中Upf1和Upf2的蛋白表达升高,说明Smg1 knockdown对Upf1和Upf2蛋白的上调作用在培养的人类细胞系中是一个普遍现象。 （4）经过Smg1 5032 SiRNA和Smg1 2999 SiRNA转染的细胞,分别提取细胞核和细胞浆蛋白,western blotting显示Upf1和Upf2蛋白表达的增高同时出现于胞浆蛋白和胞核蛋白中。结果说明,Smg1 knockdown能够导致胞浆和胞核中的Upf1和Upf2蛋白同时增加。 （5）免疫荧光染色结果显示,Smg1主要位于胞浆内,在胞核内也有少量表达;Upf1蛋白为胞浆蛋白,主要位于细胞浆内;Upf2则主要位于围绕核膜的核周区,荧光染色显示一条绿色的细线。与Luciferase SiRNA转染的细胞相比,Smg1 knockdown的细胞中Smg1的荧光强度明显降低,而Upf1和Upf2的荧光强度均明显升高。此结果与前面的结果一致,从形态学上进一步证实了Smg1 knockdown能够导致Upf1和Upf2蛋白表达的升高。 （6）经过Smg1 knockdown的细胞,其细胞中Smg1的mRNA水平明显降低,证实了Smg1 SiRNA的基因抑制作用;同时,细胞中Upf1和Upf2的mRNA水平没有显著升高或降低,说明Smg1 knockdown不能影响细胞中Upf1和Upf2的mRNA水平,其所导致的Upf1和Upf2表达增高可能是翻译后水平的升高。 结论 本研究首次阐明了Upf1和Upf2的定量调节机制,提示Smg1 knockdown导致人细胞系中Upf1和Upf2蛋白的表达升高,亦即Smg1参与Upf1和Upf2蛋白的下调。 第二部分泛素-蛋白酶体抑制剂导致Upf1和Upf2表达的升高 背景及目的 泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）是真核细胞内主要的蛋白水解酶体系,由泛素（ubiquitin,Ub）、泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme,E1）、泛素耦联酶（ubiquitin-conjugating enzymes,E2s）、泛素一蛋白连接酶（ubiquitin-protein ligating enzymes,E3s）、26S蛋白酶体（26S proteasome）以及泛素再循环酶（ubiquitin recycling enzymes）等组成。泛素分子主要通过泛素活化酶、泛素结合酶和泛素-蛋白连接酶与靶蛋白结合形成一条多泛素链,将底物蛋白泛素化,使靶蛋白被26S蛋白酶体所识别和降解。泛素一蛋白酶体系统是细胞内三磷酸腺苷（adeno-sine triphosphate,ATP）依赖的非溶酶体蛋白降解机制,可高效并高选择性地降解细胞内蛋白质,参与细胞的多种生理活动过程,比如细胞凋亡、MHC I类抗原的递呈、细胞周期以及细胞内信号传导等,对维持细胞正常的生理功能具有十分重要的意义。 UPS对蛋白质的降解包括两个连续的步骤:（1）在多种蛋白酶的作用下,多个Ub分子与底物蛋白结合,从而标记底物蛋白;（2）标记了的底物蛋白,被26S蛋白酶体识别而降解。在第一步Ub标记底物蛋白的过程中,目前认为至少需要3个接连反应来完成:首先,Ub与E1结合,形成高能硫脂键,使Ub活化;而后通过转脂作用,Ub从El转移到E2s上;活化的Ub再从E2s转移到E3s,并与底物结合,形成底物一E3s复合物,使底物发生Ub化,即多个Ub分之通过异肽键与底物蛋白链接,形成多聚泛素链。第二步:首先由26S蛋白酶体两端的19s调节亚基识别、结合并展平Ub化的底物蛋白,然后.由26S蛋白酶体的催化核心20S亚基,将蛋白质水解为多肽;最后,多聚Ub链在泛素再循环酶的作用下,释放出Ub,以重新利用,从而形成Ub的再循环途径。 为了探讨泛素-蛋白酶体系统这一被机体广泛应用的蛋白降解机制是否也适用于NMD系统,本研究采用泛素-蛋白酶体抑制剂MG132和lactacystin作用于Hela细胞,观察其对Upf1和Upf2蛋白表达的影响。 方法 利用泛素-蛋白酶体抑制剂MG132和lactacystin作用于Hela细胞,用western blot观察其对Upf1和Upf2蛋白表达的影响,用免疫荧光观察Upf1和Upf2在细胞中荧光强度的变化,用realtime-PCR方法观察其对Upf1和Upf2的mRNA水平的影响,同时用免疫共沉淀方法检测Upf1和泛素分子之间的相互作用。为了探讨Smg1和泛素-蛋白酶体系统对Upf1和Upf2作用之间的关系,本研究同时利用SMG1 knockdown和泛素-蛋白酶体抑制剂作用于Hela细胞,观察Upf1和Upf2的表达是否有所改变。 结果 （1）Western blotting结果显示,利用泛素-蛋白酶体抑制剂MG132和Lactacystin,Hela细胞中的Upf1和Upf2蛋白表达明显增加;免疫荧光染色结果中,二者的荧光强度也相应增加;但是,通过realtime-PCR的检测,我们不能观察到二者mRNA水平的变化。 （2）用泛素-蛋白酶体抑制剂MG132作用于Hela细胞,收集细胞后分别用anti Upf1抗体和anti ubiquitin抗体进行免疫沉淀检测,实验结果显示,与DMSO组细胞相比,MG132处理后的细胞与Upf1共沉淀时,Upf1的蛋白表达明显升高,但是不能观察到Upf1的条带迁移,而且也不能检测到ubiquitin的存在;在与ubiquitin共沉淀时,我们也不能观察到与Upf1分子量大小相当的条带出现。结果表明,泛素-蛋白酶体系统抑制剂不能直接导致Upf1分子的多泛素化。 （3）将泛素-蛋白酶体抑制剂MG132作用于经过SMG1 knockdown的Hela细胞中,结果发现,随着抑制剂浓度的增加,Upf1和Upf2的蛋白表达也随之增高,说明SMG1 knockdown和泛素-蛋白酶体抑制剂对Upf1和Upf2的调节具有累加作用,虽然并不排除有部分的重叠。 结论 泛素-蛋白酶体系统抑制剂导致Upf1和Upf2蛋白表达的增加,亦即泛素-蛋白酶体系统对Upf1和Upf2蛋白有下调作用。但是,Upf1分子不能被直接泛素化,推测泛素-蛋白酶体系统可能是通过其靶分子来间接地导致Upf1的降解。 Smg1 knockdown和泛素-蛋白酶体抑制剂的同时作用使Upf1和Upf2的蛋白升高具有累加效应,说明Smg1和泛素-蛋白酶体系统是通过不同的机制和通路对Upf1和Upf2进行调节的。