吲哚胺2,3-双加氧酶对肝癌血管形成的影响

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目的:吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)转染人肝癌SMMC-7721细胞,建立稳定表达IDO的细胞株,以探索IDO对人肝癌血管形成的影响,并对其机制进行初步研究。方法:1.应用lipofectamineTM2000转染试剂将pcDNA3.1-IDO、pcDNA3.1转入人肝癌细胞株SMMC-7721,经G418筛选,挑取单克隆,并进行培养,建立稳定表达IDO的细胞株。利用RT-PCR和Westernblot检测转染细胞株IDO的表达情况。2.自新生儿脐带提取脐静脉内皮细胞(HUVEC),用含20%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液培养,倒置显微镜下观察细胞的形态特点,免疫组织化学的方法对其进行鉴定。3.设未转染组、空质粒转染组、IDO转染组,收集以上3组细胞培养液。利用transwell小室将3组细胞与脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养,使其活化,将共培养后的HUVEC接种于铺有Matrigel胶的96孔板,加入已收集的对应的细胞培养液,观察HUVEC成管情况,ELISA法检测不同处理组的HUVEC培养液上清中VEGF的分泌量。4.在稳定表达IDO的SMMC-7721细胞中分别加入1-D-MT和L-色氨酸,获得IDO转染组、1-D-MT组和L-色氨酸组3组细胞,收集3组细胞培养液。利用transwell小室将转染组细胞与HUVEC共培养,使其活化,将共培养后的HUVEC接种于铺有Matrigel胶的96孔板,加入收集的含有色氨酸、1-D-MT和IDO转染的SMMC-7721细胞培养液,观察HUVEC细胞成管及VEGF分泌的影响。结果:1.RT-PCR显示:IDO转染组扩增出464bp的IDO基因片段,空质粒转染组与未转染组均未扩增出基因片段。WesternBlot显示:IDO转染组表达IDO蛋白,空质粒转染组与未转染组不表达IDO蛋白。2.倒置显微镜下观察脐静脉内皮细胞为多角形,呈铺路石样排列,免疫组化可见脐静脉内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。3.IDO转染组(24.56±0.16)HUVEC成管数目较未转染组(10.38±0.67)、空质粒转染组(11.02±0.14)有明显增多(P<0.05);IDO转染组(727.65±0.48)分泌的VEGF较未转染组(512.05±1.11)、空质粒转染组(519.35±0.38)增多(P<0.05),差异均有统计学意义。4.IDO转染组(24.84.±0.54) HUVEC成管数目较色氨酸组(15.14±0.24)、1-D-MT组(14.68±0.84)增多(P<0.05);IDO转染组(727.65±0.83)分泌的VEGF较色氨酸组(576.00±1.34)、1-D-MT组(574.65±5.83)增多(P<0.05),差异均有统计学意义。结论:IDO转染的SMMC-7721细胞通过代谢色氨酸途径影响血管内皮生长因子(VEGF)的表达进而影响血管形成。
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