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一.研究目的：(1)探讨ZMY对阿霉素引起的大鼠原代心肌细胞毒性的保护作用、ZMY对阿霉素引起的小鼠心脏毒性的保护作用,以及ZMY对阿霉素心脏毒性保护作用的分子机制。(2)探讨苏尼替尼引起的大鼠H9c2心肌细胞毒性作用,并探索ZMY对苏尼替尼引起的心肌细胞毒性的保护作用机制。二.研究方法：1.ZMY抗氧化活性及抗肿瘤活性作用研究：(1)DPPH法测定ZMY体外抗氧化活性研究；(2)MTT法测定ZMY与阿霉素合用对K562、NB4、U937白血病细胞的协同抑制作用；(3)建立U937裸小鼠移植瘤模型评价ZMY与阿霉素合用的体内抗肿瘤活性。2.ZMY对阿霉素引起的大鼠原代心肌细胞毒性的保护作用及其机制研究包括：(1)MTT法测定阿霉素及合用ZMY对大鼠原代心肌细胞的抑制作用；(2)全自动生化分析仪测定阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌细胞上清心肌酶谱的变化；(3)DCF法测定阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌细胞内活性氧(ROS)生成水平变化；(4)DAPI染色法检测阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌细胞的凋亡情况；(5)JC-1法测定阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌细胞线粒体膜电位的变化；(6)Western-blot检测阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌细胞内凋亡蛋白的变化。3.ZMY对阿霉素引起的小鼠心脏毒性的保护作用研究：(1)建立ICR小鼠阿霉素心脏毒性模型,观察合用ZMY后小鼠体重的变化；(2)观察合用ZMY后小鼠存活率的变化；(3)观察合用ZMY后小鼠血清心肌酶谱的变化。4.苏尼替尼引起的大鼠H9c2心肌细胞毒性作用及其机制研究包括：(1)MTT法测定苏尼替尼对H9c2细胞的抑制作用,计算ICso值；(2)DAPI染色法检测苏尼替尼作用后H9c2细胞的凋亡情况；(3)AO染色法检测苏尼替尼作用后H9c2细胞内酸性自噬泡生成情况；(4)转染GFP-LC3质粒检测苏尼替尼作用后H9c2细胞内自噬泡生成情况。(5)Western-blot检测苏尼替尼作用后H9c2细胞内凋亡蛋白和自噬蛋白的变化；(6)siRNA法沉默Beclinl基因的表达,抑制细胞自噬的水平,MTT法测定苏尼替尼作用后细胞存活率的变化；5.ZMY对苏尼替尼引起的大鼠H9c2心肌细胞毒性的保护作用及其机制研究包括：(1)MTT法测定苏尼替尼及合用ZMY对H9c2细胞的抑制作用的变化；(2)DCF法测定苏尼替尼及合用ZMY对H9c2细胞内活性氧生成水平变化；(4)AO染色法检测苏尼替尼及合用ZMY后H9c2细胞自噬情况的变化；(5)Western-blot检测苏尼替尼及合用ZMY后H9c2细胞内自噬相关蛋白的变化。三.研究结果：1.ZMY具有很强的抗氧化活性并能协同增强阿霉素的体内外抗肿瘤活性：(1)ZMY具有良好的DPPH自由基清除作用,其自由基清除能力超过维生素C；(2)ZMY与阿霉素合用对三种白血病细胞表现出较强的体外协同抑制作用；(3)在U937裸小鼠移植瘤模型中,给药6天后,ADR 2 mg/kg、ZMY 500 mg/kg和合用组肿瘤抑瘤率(%)分别为14.5、18.0和57.1,T/C(%)值分别为69.4、73.5和41.3。结果证实ADR 2 mg/kg和ZMY 500mg/kg合用时可以显著抑制U937肿瘤的生长,具有很好的协同抗肿瘤效果。2.ZMY通过其抗氧化活性对阿霉素引起的大鼠原代心肌细胞毒性的保护作用及机制：(1)ZMY对阿霉素引起的大鼠原代心肌细胞毒性作用表现出较强保护作用,阿霉素作用24 h后阿霉素2μM单用组和50μM ZMY预处理组细胞抑制率分别为30.7%、14.5%；(2)心肌酶谱检测结果显示ZMY预处理组细胞比阿霉素单用组AST、LDH、CKMB值显著下降；(3)作用3h后阿霉素2μM单用组ROS的生成为241.5%,50μM ZMY预处理组细胞阿霉素作用3h后,ROS生成为80.0%,与阿霉素单用组相比ROS的水平显著降低；(4)DAPI染色发现,合用ZMY后阿霉素引起的大鼠原代心肌细胞的凋亡率随之降低；(5)合用ZMY后可以逆转阿霉素引起的大鼠原代心肌细胞线粒体膜电位的降低；(6)Western-blot结果显示,ZMY可以通过抑制ERK,进而抑制P53激活来减少阿霉素引起的心肌细胞凋亡,同时实验结果表明ZMY还可以通过抑制JNK, P38激活,抑制凋亡。3.ZMY表现出很强的体内心脏毒性的保护作用：(1)在ICR小鼠阿霉素心脏毒性模型中,合用ZMY后小鼠体重下降比阿霉素单用组明显变慢；(2)阿霉素给药6天后,500mg/kg ZMY合用组ICR小鼠存活率为84.62%,阿霉素单用组为7.69%,结果证实ZMY和阿霉素合用时可以显著提高ICR小鼠存活率；(3)阿霉素单用组血清AST值为578±84 IU/L,与合用ZMY 500mg/kg组值276±102IU/L有显著差异；阿霉素单用组LDH值为1603±303 IU/L,与合用ZMY 500mg/kg组值293±199IU/L有显著差异；阿霉素单用组CKMB值为922±120 IU/L,与合用ZMY500mg/kg组值248±270 IU/LL有显著差异。4.苏尼替尼引起的大鼠H9c2心肌细胞毒性作用与细胞自噬有密切的关系：(1)苏尼替尼对大鼠H9c2心肌细胞表现出较强的细胞毒性作用,作用48 h后计算半数抑制浓度IC50值为6.53 pM；(2)DAPI染色发现,随着苏尼替尼给药浓度的升高,H9c2细胞的死亡率随之升高,但凋亡现象不明显；(3)AO染色发现,苏尼替尼作用后H9c2细胞内酸性自噬泡生成明显增加；(4)通过转染GFP-LC3质粒发现,苏尼替尼作用后H9c2细胞内自噬泡生成明显增加；(5)Western-blot结果显示,苏尼替尼作用后H9c2细胞内凋亡蛋白的表达没有明显的变化,但是细胞内自噬蛋白LC3、Beclinl的表达与苏尼替尼存在明显的浓度依赖性和时间依赖性关系；(6)siRNA法沉默Beclinl后,抑制细胞自噬的水平,与相应对照组相比苏尼替尼作用后细胞存活率明显增加。5.ZMY对苏尼替尼引起的大鼠H9c2心肌细胞毒性具有比较明显的体外保护作用：(1)ZMY对苏尼替尼引起的H9c2细胞的抑制作用表现出明显保护作用,作用24 h后苏尼替尼5 pM单用组和50μMZMY预处理组细胞抑制率分别为28.3%、3.1%；(2)ROS检测结果显示,苏尼替尼作用3h后,H9c2细胞内活性氧生成明显增加,呈现出明显的浓度依赖性关系；合用ZMY后,与苏尼替尼单用组相比ROS生成显著降低；(3)AO染色发现,合用ZMY后苏尼替尼引起的H9c2细胞内酸性自噬泡的生成明显减少；(4)Western-blot结果显示,ZMY可以通过抑制JNK激活来抑制苏尼替尼引起的Beclin1上调,从而抑制自噬的激活。四.结论：(1)ZMY对阿霉素引起的心脏毒性表现出明显的体内外保护作用；(2)苏尼替尼引起的大鼠H9c2心肌细胞毒性作用与细胞自噬有密切的关系；(3)ZMY能显著抑制苏尼替尼引起的细胞自噬,减少其心肌细胞毒性作用。