本研究的目的是研制一种成骨能力优良的骨缺损修复材料,具有优良的注射性和可塑性,富含成骨活性成分DBM,并可为新骨再生提供钙磷离子成分,降解性-成骨性优良,X线下可以显影,在一定程度上缓解骨源不足的问题。研究分为以下几个部分:第一部分球形纳米晶HA和TCP的制备与评价目的:采用化学方法合成球形纳米晶的HA/TCP材料。采用成骨细胞对材料进行细胞活性评价。方法:以Ca(NO3)2和(NH4)2HPO4为实验原料,调节Ca(NO3)2溶液的p H值为10-11,(NH4)2HPO4溶液的p H值为9-10;分别按Ca/P为9:5和3:5混匀后,调节p H值保持在10-11,25°C振荡24h;陈化、清洗、干燥。将干燥后的粉体800°C煅烧2h。对煅烧前后的粉体进行XRD和SEM表征,确定物相和形貌以及颗粒大小。培养MC3T3-E1成骨细胞,用该细胞系对煅烧后的两种材料进行体外细胞相容性研究,观察指标选择为细胞增殖、碱性磷酸酶蛋白表达水平和功能性成骨指标COL-1的基因表达水平以及细胞生长状态。结果:对合成的粉体进行XRD测试,结果显示煅烧之前获得的9:5和3:5 Ca/P两种前驱体晶体结构相似,各衍射峰位置均与HA的标准卡相对应,在经过800°C烧结之后,Ca/P=9:5材料为结晶度理想的HA材料,而Ca/P=3:5材料为具有较高结晶度的TCP材料。SEM显示煅烧之前Ca/P为3:5和9:5前驱体材料均为颗粒直径为44-248 nm球形纳米晶形貌,在形貌上两者类似。经过800°C煅烧得到的HA和TCP依然为纳米球形结构。MTT结果表明,与对照组相比两种材料组的细胞增殖率均明显升高。其中,TCP对细胞增殖的促进作用优于HA(P<0.05)。此外,TCP组碱性磷酸酶的活性明显高于HA组(P<0.05)。PCR结果显示,两个材料组表面成骨细胞均有COL-I的表达,且表达量随时间递增,结果依然是TCP组优于HA。结论:本实验成功的利用了传统化学湿法合成过程,在特定原料比例、配置混合方法和反应条件下,合成出了纯度较高的纳米羟基磷灰石。煅烧后成功制得球形纳米晶的羟基磷灰石和磷酸钙。经成骨细胞实验验证,具有很好的细胞相容性,且球形纳米晶TCP组材料在细胞增殖、ALP活性及COL-I基因表达等方面甚至优于相似纳米晶的HA,在应用中可适当增大TCP的用量。第二部分DBM的制备与活性评价目的:制备兔DBM并对其钙含量和骨诱导活性进行验证,为后续研究提供材料基础。方法:选用健康的6个月龄的新西兰长耳兔10只。将兔处死后,取兔四肢管状皮质骨,去除干骺端及肌肉等软组织,深低温-80℃冷冻4周降低抗原性,超声清洗去脂无杂质,冻干后粉碎过筛,取24-50目颗粒进行后续实验。将骨粉置入0.5mol/L盐酸常温脱钙24h,纯化水多次冲洗至p H为6.0左右。冷冻干燥、密封、25KGy 60Co辐照灭菌。即为脱钙骨基质DBM样品,观察样品的外观变化。取1g样品,用煮沸的水稀释20倍,超声震荡10分钟后静置10分钟,测其p H。另取0.5g骨粉和DBM,用浓HNO3浸泡,电炉高温消化完全,分别置入100ml容量瓶,定容;利用等离子发射光谱仪(ICP)检测钙含量。选取10只裸鼠进行双侧实验,左侧实验对照组兔粉,右侧为实验组DBM。用0.3%戊巴比妥钠麻醉,在小鼠腿部肌间隙分别植入样品。术后28天取材,固定,经过脱水、包埋、切片等过程,制成标本切片,HE染色观察组织学反应。观察是否有软骨样组织或骨样组织形成。按照骨诱导活性评分OI标准进行活性分级。结果:脱钙后制备的兔DBM为乳白色,粒径为150μm-700μm。实验测得骨粉和兔DBM的p H分别为6.2±0.5、6.1±0.6,均符合国家要求(5.8-7.5)。等离子发射光谱分析法测量得兔粉即正常兔四肢骨的钙含量占总重量的21.34-25.34%。DBM钙含量明显降低,最少为4.9%。术后裸鼠,伤口愈合较好,4W观察发现,皮肤上无手术痕迹,肌肉内能看到异物,此外少数肌肉上发现部分线头未被吸收完全;X光片影像学显示两个实验组手术部位中未经脱钙处理的兔粉有明显的显影,兔DBM的术后区域X线下显影不明显;组织学观察显示,植入物周围无明显炎症反应;对照组骨粉植入后4W无明显的新骨生成,存在大量脂肪细胞形成的空泡结构,有纤维结缔组织长入,而DBM组有明显的新骨和软骨形成,可见大量成骨细胞和软骨细胞以及中央有类骨髓腔结构形成。结论:利用改进的Urist方法,严格控制制备过程,我们成功得到了兔DBM,且动物体内实验证明该兔DBM具有骨诱导活性。为后续复合材料制备和动物实验提供了必要的材料基础。第三部分甘油明胶赋形剂材料的制备与评价目的:在临床手术中,我们国内现有的骨颗粒或粉末在手术操作中成型性很差。目前已知的生物赋形剂材料均不能耐受60°C辐照灭菌。为解决该类材料终末灭菌的问题,本研究以甘油为溶剂制备出一种可采用辐照灭菌并且易于保存的溶胶-凝胶赋形剂。方法:称取不同量的明胶于烧杯中,加入适量的水浸泡,待其充分溶胀;将25m L甘油置于70℃的烘箱,加热30min后,将明胶与甘油趁热混合,搅拌均匀;继续加热5min,取出,自然冷却,除去上层气泡层;用500μW/m2紫外线照射2 h,放入-20°C冰箱稳定72 h,即得不同浓度的甘油明胶基质。检测各个基质的p H;采用DSC-60型-差热分析仪对材料的相转化温度进行测试;通过安东帕MCR302高级旋转流变仪对基质的流变性进行检测;观察辐照灭菌4.0%壳聚糖,1.0%透明质酸钠,2.0%海藻酸钠以及1.0%甘油明胶四种流体粘度和p H的影响;以PBS为模拟体液,将制备的不同浓度明胶含量的基质均稀释10倍,测各个基质体外溶解速率,每隔2小时观察一次;以BALB/c-小鼠为试验模型,进行体内植入试验,观察其术后1天、3天、7天的组织学反应,HE染色观察基质的生物相容性。结果:随着甘油明胶基质中明胶浓度的增加,基质的p H一直稳定在5.60左右。常温下,当明胶含量小于等于2.0%时,基质为可以流动的溶胶;当明胶含量大于等于2.5%时,基质变为凝胶,不在具有流动性,而加热到一定温度其有转变为具有流动性的溶胶。从DSC曲线和温度扫描结果看相转化在46~50°C。随明胶浓度的增大,基质的模量也在上升,弹性模量从几十变到1500左右;赋形剂的3ITT测试发现50s内胶体的粘弹模量值可以恢复到原来的90%。1.0%透明质酸钠(SH)、4.0%壳聚糖(CS)、2.0%海藻酸钠(SA),经过辐照后除了1.0%溶胶,其他三种赋形剂的粘度值均低于10 Pa·s;而1.0%溶胶的粘度也下降为583 Pa·s;p H值在5.66-7.43变化;辐照前后5.0%凝胶粘性模量几乎没有变化,弹性模量略有减低。12h内胶体可以完全溶解(24小时以内去除不影响材料的骨诱导活性、细胞的浸润);组织学结果说明,甘油明胶基质具有很好的组织相容性和降解性能。结论:以甘油为溶剂,研究制备出可以采用辐照方法灭菌的赋形剂。这种溶胶-凝胶基于不同明胶含量的变化可以展现出较大的模量跨度,基于这一点该赋形剂存在广阔的使用空间。可采用60Co-γ射线辐照灭菌的溶胶-凝胶载体材料,将为复合制剂的生产工艺提供极大的便利,很大程度上降低了无菌操作设施和工艺所产生的生产成本和工艺过程风险。鉴于基质的稳定性和安全性,可以进一步扩展其在医药和食品工业上的应用。第四部分注射式DBM/HA-TCP复合材料的制备与评价目的:制备注射式DBM/HA-TCP复合材料,选用兔子骨缺损模型进行实验,手术部位为髂骨,评价复合材料骨缺损修复的效果,寻求兔DBM与HA-TCP的优化复合比例。方法:首先将煅烧后的HA和TCP材料按照60:40的比例混合(国内外常用比例为70:30和60:40,本研究选用了较高的TCP比例),充分混合后得到的为双相磷酸钙即BCP复合粉体;将兔的DBM与BCP复合粉体混合,按照不同DBM和BCP比例分别制备100%DBM、25%BCP、50%BCP、75%BCP、100%BCP五种混合材料;将混合材料与甘油明胶混合均匀,甘油与复合粉的比例10:8,得到5组样本,包装后辐照灭菌。将五种材料进行注射性能测试,并在X线下曝光成像。在兔子的髂骨部位,以环形钻于髂骨部位上钻出直径约6mm,长10mm,深度约5mm的洞形缺损,在兔子的左右髂骨各制备3个,共计6个洞形的骨缺损模型,将五组材料分别植入到实验兔的骨缺损处,并保留一个空白组作为对照。术后连续注射青霉素5天,分别于4周、8周观察。采用Micro-CT评价局部的骨量和骨质变化;荧光标记后,于荧光显微镜下观察荧光双标带之间的宽度差异以计算成骨速率;此外还要进行VG染色组织学观察。结果:这五种材料进行注射时的载荷均小于50N,于X线下曝光成像,100%DBM注射材料几乎不显影,随着HA和TCP复合无机粉体的加入,注射式复合材料的显影密度逐渐增加。术后,部分动物手术部位出现不同程度肿胀,约2周后消失。根据Micro-CT结果推测,8W时除空白组外其余各组手术部位的恢复状态良好,中央有不同程度的缺损区域。在荧光显微镜下各标本中均可见黄绿色标记,各个实验组的新骨小梁生长都比较旺盛,75%BCP组矿化沉积率最高。VG组织学观察发现各个组的新骨小梁生长都比较旺盛,未发现无机粉体和DBM。最终结果为75%BCP组新骨生成效果最佳。结论:综合各评价结果,本研究制备出了具有可注射塑形的高效成骨活性的注射式兔DBM/HA-TCP复合材料。