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随着体外循环(cardiopulmonary bypass, CPB)技术的不断发展,临床上越来越多的手术需借助CPB,同时CPB术后引起心、肺、肾等重要脏器损伤也受到广大心胸血管外科医生的关注与重视,临床发现,经历CPB的患者中有7-40%出现肾功能损伤。当大量的心、肺、肝等脏器保护措施和药物开始广泛应用于临床,CPB术后肾脏损伤对术后患者恢复和预后的影响逐渐显现出来。但目前相较于心、肺、肝等脏器而言,CPB导致肾脏损伤的机制仍未能得到明确的阐述,因此在不断深入探讨CPB术后肾脏损伤机制同时,选择有效的药物干预亦是现阶段研究的重点。促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)是一种组织在缺血、缺氧时由肾脏及肝脏产生的造血因子。目前临床上EPO主要用治疗肾性贫血以及肿瘤等各种慢性疾患所伴发的贫血,近来研究发现,EPO还有抗氧化、抗凋亡、调节炎症反应等作用。因此,本课题旨在研究促红细胞生成素对大鼠CPB术后肾脏损伤的保护作用及可能的机理。第一部分：大鼠体外循环术后肾脏损伤的研究目的研究体外循环对大鼠肾脏的损伤,并探讨其可能机制。材料和方法选用成年SD大鼠30只,随机均分为2组：假手术组(Sham组)、手术组(CPB组)。Sham组行CPB血管穿刺等类似操作,但不实施CPB。手术组建立体外循环,最大流量(>100ml/Kg/min)转流60min。于肝素化后转流前(T1)和转流结束后(T2)进行动脉血气分析。测肝素化后转流前(TO)、转流结束后(T1)、术后0.5小时(T2)、术后1小时(T3)、术后2小时(T4)以及术后24小时(T5)的血清肌酐(creatinine,Cr)尿素氮(blood ureanitrogen,BUN)水平。术后24小时取肾脏组织,用酶联免疫吸附实验方法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测组织中组织肿瘤坏死因子(TNF)-α,白细胞介素(IL)-1β、白细胞介素(IL)-6等炎性因子浓度,分别用Real-time PCR和western blotting方法检测核因子-kB (nuclear factor-kappaB, NF-kB)P65、细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)基因及蛋白表达水平,并行HE染色观察组织形态改变。统计软件为SPSS13.00软件包,p<0.05时差异有显著意义。结果体外循环后大鼠平均动脉压(mean artery pressure, MAP)、红细胞压积(haematocrit, HCT)、动脉血氧分压PaO2和PH值较Sham组有统计学差异,但仍在可接受范围内。与Sham组相比,CPB组大鼠在T1至T5各时间点血清Cr、BUN水平明显升高(P<0.05),呈上升趋势,而在T0时2组无显著差异；CPB组肾组织中TNF-a、IL-1β. IL-6含量均明显高于Sham组(P<0.05)；CPB组肾组织中NF-kB P65> ICAM-1表达水平亦显著升高(P<0.05)；术后24小时Sham组肾脏组织在显微镜下结构基本正常,CPB组肾小管上皮及肾小球毛细血管内皮细胞肿胀明显,管腔变窄或闭合,有较多炎症细胞浸润,肾间质血管扩张充血,肾小球及球后毛细血管内存积有成堆的结构破坏的红细胞及血红蛋白,呈明显的组织损伤特征。结论1、利用大鼠体外循环模型研究体外循环后肾脏损伤,本模型具有可靠、成熟、简便、经济、重复性好等优点。2、在体外循环术后肾脏损伤过程中,CPB可能是通过激活肾组织NF-kBP65蛋白及基因,上调ICAM-1及TNF-a、IL-1β、IL-6等炎症因子表达,引起肾脏损伤。第二部分：促红细胞生成素对体外循环术后大鼠肾脏的保护作用目的研究促红细胞生成素对体外循环后大鼠肾脏损伤的保护作用。材料和方法选用成年SD大鼠36只,随机均分为3组：假手术组(Sham组)、手术组(CPB组)、EPO干预组(EPO组)。Sham组行CPB穿刺等操作,但不实施体外循环(CPB)。其余2组均建立体外循环,最大流量(≥>100ml/Kg/min)转流60min。EPO组于转流前在预充液中加入3000U的EPO。实验过程中记录血压和心率变化,并于肝素化后转流前(T1)和转流结束后(T2)进行动脉血气分析。测肝素化后转流前(TO)、转流结束后(T1)、术后30min (T2)、术后1h(T3)、术后2h(T4)以及术后24h(T5)的血清肌酐(creatinine,Cr)、尿素氮(blood ureanitrogen,BUN)水平。术后T5取肾脏组织,用酶联免疫吸附实验方法(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)检测组织中组织肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、白细胞介素(IL)-6等炎性因子浓度,分别用免疫组化和western blotting方法检测核因子-kB (nuclear factor-kappaB, NF-KB)P65^细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)蛋白表达水平,行HE染色观察组织形态改变。统计软件为SPSS13.00, p<0.05为差异显著。结果体外循环后大鼠MAP较术前有改变,但仍在可接受范围。血气分析结果提示,术后Pa02明显升高,红细胞压积HCT降低较多,其余无明显变化。在T1-T5各时间点,CPB组血清Cr、BUN水平均呈明显高于Sham组；EPO组较CPB组显著下降,而TO时3组间无明显差异。CPB组肾组织NF-kB p65、ICAM-1蛋白及TNF-a、IL-1β IL-6等炎性因子表达水平显著高于Sham组,然而予以EPO干预后,EPO组大鼠肾组织这些指标变化趋势明显被逆转。免疫组化显示NF-kB p65在Sham组见少量阳性表达,但CPB组在肾小管上皮细胞高度表达,亦表达于血管内皮细胞,表现为胞核上不均匀的黄褐色颗粒状物,EPO干预后阳性细胞表达明显减少；ICAM-1主要在肾小球毛细血管、系膜区、间质大量表达,肾小管中亦有表达,表现为不均匀的棕黄色颗粒状物；Sham组基本无阳性表达,CPB组阳性表达显著增加,EPO组阳性表达明显减少。HE染色显示Sham组肾小球、肾小管结构基本完整。CPB组肾组织出现明显的病理改变,肾小管上皮及肾小球毛细血管内皮细胞肿胀明显,管腔变窄或闭合,有炎症细胞浸润,肾间质血管扩张充血,肾小球及球后毛细血管内存积有成堆的结构破坏的红细胞及血红蛋白,呈明显的组织损伤特征,EPO组较CPB组炎症细胞浸润及肾组织损伤程度明显减轻。结论在大鼠体外循环模型中,应用促红细胞生成素能很好的减轻体外循环对肾脏造成的损伤,可能是通过抑制NF-kB p65的激活,进而下调ICAM-1、 TNF-a、 IL-1β, IL-6等炎症因子的表达,起到肾脏保护作用。