植物根系结构的形成和生长发育受内外因素的共同调节,大量研究证实接触刺激是影响根系生长行为的重要因素之一。三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)能够调控胞外基质中ATP(eATP)的浓度,在植物生长发育中具有十分重要的作用。但是apyrase及eATP信号是否也在植物根系的接触刺激响应过程中发挥作用还未见报道。因此本文建立了对植物根系实现持续机械刺激的加载平台,以模式植物拟南芥主根为研究对象,定量研究野生型(WS)与APY1-7突变体主根在器官、细胞水平上响应接触刺激的差异。通过引入高灵敏度的实时生物传感技术建立了检测eATP浓度的方法,研究了apyrase表达与eATP浓度差异在拟南芥主根响应接触刺激中的作用规律。进一步结合细胞骨架的活体观测实验,研究了apyrase与细胞骨架结构和排布在主根接触刺激响应中的相互关系。研究阐明了apyrase及eATP在拟南芥主根响应接触刺激中具有十分重要的调控作用,为以后apyrase功能的完整阐明提供了宝贵的线索,是对现有apyrase和接触刺激在调控植物生长发育作用理解的重要补充。本文的主要研究内容和结论如下:1.利用对植物根系实现持续机械刺激的加载平台,筛选在主根接触刺激响应中潜在的拟南芥apyrase。①通过调节培养介质硬度、粗糙度及表面角度,建立对植物根系形成持续机械刺激的加载平台。②研究发现拟南芥APY1和APY2突变体主根在琼脂表面显著向右偏斜生长,而APY3-7突变体主根无偏斜生长趋势。③单基因敲除的apy1突变体主根与野生型相比在正常生长条件及机械刺激下显著的向右偏斜生长,过量表达APY1会抑制这种偏斜生长,且突变体主根外表皮细胞系的趋向性也和野生型存在显著差异。④apy1和apy2突变体主根长度显著短于野生型主根,过量表达APY1和APY2的突变体主根显著长于野生型。⑤进一步研究发现APY1和APY2表达受到抑制的RNAi突变体(R2-4A)主根的生长受到显著抑制,且完全失去向重性生理反应。以上结果表明,APY1和APY2在调控拟南芥主根接触刺激响应中具有十分重要的作用。2.从化学阻断的角度研究apyrase和生长素对拟南芥主根接触刺激响应的影响。①通过在琼脂培养基中添加两种apyrase抑制剂apyrase inhibitor 4和NGXT13,发现野生型和突变体主根在琼脂表面显著向右偏斜生长,但是偏斜生长的程度存在显著差异,这表明apyrase的活性是拟南芥主根响应接触刺激的必要条件。②进一步组织化学分析的结果发现两种apyrase抑制剂影响了主根生长素的极性运输,0.5μM生长素输出抑制剂NPA也诱导野生型和apyrase突变体主根偏斜生长。实验结果表明apyrase调控拟南芥主根在琼脂表面的接触刺激响应和生长素极性运输有关。3.引入高灵敏度的实时生物传感技术建立了定量检测eATP浓度的方法,对拟南芥野生型和apyrase突变体主根附近的eATP进行了研究。①发现野生型拟南芥主根根尖的eATP浓度为2.3±0.3nM。RNAi突变体主根根尖附近的eATP浓度是野生型拟南芥的40倍,伸长区eATP浓度是野生型拟南芥的80倍。过量表达APY1和APY2的突变体主根附近eATP浓度均低于0.5nM。结果表明APY1和APY2对细胞eATP浓度具有十分重要的调控作用。②外源添加2mM ATP和150μM ATPγS也会诱导野生型拟南芥和apyrase突变体主根显著向右偏斜生长,且由ATP诱导的主根显著偏斜生长并不是其磷酸化或二级产物诱导的结果。这表明外源ATP和内源ATP都在拟南芥主根接触刺激响应中发挥重要作用。4.基于apy1突变体主根的偏斜生长和外表皮细胞系螺旋表型与微管骨架相关突变体的生长表型十分相似,研究了apyrase与细胞骨架在拟南芥主根响应接触刺激中的相互作用。①通过在培养基中添加微管稳定剂Taxol和解聚剂Propyzamide,发现在主根偏斜生长和外表皮细胞系螺旋方面,野生型和APY1突变体主根对微管特异性药物的敏感性存在显著差异,这表明APY1可能与微管骨架功能相关。②进一步激光共聚焦显微镜对GFP-MBD主根伸长区外表皮细胞骨架活体观测的结果表明,添加apyrase抑制剂会扰动微管骨架的正常结构和排布,微管束出现断裂成核和荧光斑点聚集的现象。结果表明apyrase通过调控皮层微管骨架的结构和排布在拟南芥主根接触刺激响应中发挥作用。