第一部分:磁性分离法分离培养小鼠肺动脉平滑肌细胞目的:通过磁性分离法分离小鼠原代肺动脉平滑肌细胞,提高细胞分离的成功率,为体外培养原代肺动脉平滑肌细胞并构建低氧模型打下良好的实验基础,同时对小鼠原代肺动脉平滑肌细胞的分离方法提出新思路和新参考。方法:1.选取体重20g左右的健康成年C57BL/6J小鼠,在无菌条件下采用腹腔注射4%水合氯醛(0.01ml/g)对小鼠进行麻醉。2.麻醉后,解剖小鼠使其暴露肾脏并切断肾动脉除血,之后暴露胸腔,自右室向肺动脉方向缓慢注入灭菌的PBS液3-5ml,直到肺变白,用钝性分离器分离暴露气管。3.向肺右室内缓慢注入PA agarose 3-5ml,直到肺变成灰色。将Lung agarose 2-3ml注入气管内,直到凝胶充满肺组织。取走心肺,置入冰冷PBS液约5分钟,使凝胶凝固。4.弃掉肺动脉主干及左右肺动脉分支,切碎肺组织,移入50ml灭菌离心管中,连接磁铁,此时含铁组织会移至靠近磁铁的离心管管壁上,吸出PBS液,用灭菌的PBS液5ml清洗肺组织3次。5.向离心管中加入6ml胶原酶溶液,倒入培养皿,37℃消化1小时。1小时后,用20ml注射器反复抽吸肺组织与胶原酶,移入灭菌50ml离心管,连接磁铁,吸走上层液,用5ml完全培养液清洗3次,灭活胶原酶,最后加完全培养液,倒入培养皿,放入培养箱内过夜(5%CO2,37℃)。6.第2天,将培养皿内组织碎片倒入50ml离心管,弃掉培养皿,连接磁铁,完全培养液清洗3次,再倒入新的无菌培养皿内,置于5%CO2,37℃培养箱继续培养,3-5天更换培养液。在培养过程中,据细胞生长情况可再次磁性分离培养皿内组织碎片,倒入新的培养皿内,收集细胞。7.通过调整培养基的方法,使肺动脉平滑肌细胞成为所收集细胞中的优势细胞。8.在第一次传代中,将细胞悬液靠近磁铁,含铁颗粒受磁力吸引被分离,从而获得较纯的细胞。进而进行传代和稳定培养。9.通过普通光学显微镜以及激光共聚焦显微镜对所分离的细胞进行鉴定。结果:1.在首次分离肺动脉平滑肌细胞后,通过普通光学显微镜可见呈黑色且含有铁颗粒的小血管组织碎片。表明铁粉与凝胶混合液经右室向肺动脉内注射成功,铁粉通过凝胶充满肺动脉内。3天后可见细胞从含铁小血管周围爬出,细胞形态表现为长梭形放射状。经过传代,在7-10天后血管平滑肌细胞呈“峰-谷”状生长。由此,从形态学初步鉴定为肺动脉平滑肌细胞。2.在激光共聚焦显微镜下观察免疫荧光染色的小鼠肺动脉平滑肌细胞,蓝色为细胞核,绿色荧光为平滑肌蛋白阳性表达,红色荧光表示平滑肌肌球蛋白重链阳性。通过免疫荧光中两种平滑肌细胞相关的特异性蛋白的阳性表达,说明磁性分离法所分离的细胞为肺动脉平滑肌细胞。结论:采用磁性分离法分离培养小鼠肺动脉平滑肌细胞的方法切实可行,分离出的肺动脉平滑肌细胞状态良好,为后续实验的进行奠定了良好的基础。第二部分:低氧对肺动脉平滑肌细胞增殖和新奇型蛋白激酶C表达的影响目的:1.明确低氧对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响。2.明确低氧对肺动脉平滑肌细胞中新奇型蛋白激酶C表达的影响。方法:1.磁性分离法分离健康成年的C57BL/6J小鼠的原代肺动脉平滑肌细胞,经体外培养传代至细胞稳定生长。2.选取生长状态良好的小鼠肺动脉平滑肌细胞,按照不同的低氧处理时间,将细胞分为低氧24h组、48h组、72h组并且每组均设置常氧对照组。CCK-8法、Brdu法检测各组细胞的增殖率。3.选取生长状态良好的小鼠肺动脉平滑肌细胞,按照不同低氧处理时间,将细胞分为低氧0h组、24h组、48h组、72h组,流式细胞术、Western blot检测不同低氧诱导时间下PKCδ、PKCε、PKCε、PKCζ四种不同的PKC的表达情况。4.对各组实验结果进行数据整理和统计学分析。结果:1.低氧可以促进肺动脉平滑肌细胞增殖。由CCK-8检测结果可知,低氧24h组与常氧24h组的细胞存活率无明显差别(P>0.05),同样低氧48h组与常氧48h组的细胞存活率也无明显差别(P>0.05)。但是低氧72h组相比于常氧72h组的细胞存活率有明显的提高(P<0.05)。由Brdu检测细胞增殖结果可知,低氧24h组与常氧24h组相比无明显差别(P>0.05),低氧48h组与常氧48h组的细胞存活率有提高(P<0.05)。低氧72h组相比于常氧72h组的细胞存活率有明显的提高(P<0.05)。CCK-8与Brdu的结果一致,可见低氧可以促进肺动脉平滑肌细胞的增殖且低氧诱导72h时肺动脉平滑肌细胞的增殖效果显著增加,所以选取低氧诱导72h作为后续实验条件。2.低氧可以诱导肺动脉平滑肌细胞中PKCδ、PKCε表达的上调。由流式细胞术检测结果可知,PKCδ、PKCε在低氧72h时的表达情况显著提高(P<0.05)而PKCε、PKCζ在低氧72h时的表达无显著差异(P>0.05)。Western blot检测结果同样显示PKCδ、PKCε在低氧72h时的表达情况显著提高(P<0.05)而PKCε、PKCζ在低氧72h时的表达无显著差异(P>0.05)。由以上两种结果可知,在肺动脉平滑肌细胞中,低氧可以诱导肺动脉平滑肌细胞中PKCδ、PKCε表达的上调而PKCε、PKCζ的表达无明显变化。结论:1.低氧条件可以诱导小鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖且在低氧处理72h时增殖效果最显著。2.低氧可以诱导小鼠肺动脉平滑肌细胞中PKCδ、PKCε表达的上调。第三部分:低氧通过上调PKCδ和PKCε而促进肺动脉平滑肌细胞的增殖目的:1.明确低氧诱导PKCδ、PKCε上调与肺动脉平滑肌细胞增殖间的关系。2.明确低氧诱导PKCδ、PKCε上调后影响肺动脉平滑肌细胞增殖的可能机制。方法:1.采用磁性分离法分离健康成年的C57BL/6J小鼠的原代肺动脉平滑肌细胞,经体外培养传代至细胞稳定生长。2.选取生长状态良好的肺动脉平滑肌细胞,根据不同的干预处理将其分为以下几组。常氧对照组(Normoxia)、常氧+PKCδ激动剂组(Normoxia+PMA)、低氧组(Hypoxia)、低氧+PKCδ抑制剂组(Hypoxia+Rottlerin)。常氧对照组(Normoxia)、常氧+PKCε激动剂组(Normoxia+PMA)、低氧组(Hypoxia)、低氧+PKCε抑制剂组(Hypoxia+PKCεinhibitor pepitide)。3.构建含有sh RNA片段分别抑制PKCδ和PKCε的慢病毒载体,并设置空载慢病毒载体对照组。按照不同干预进行分组:不转染慢病毒组(Normal)、转染空载慢病毒组(Scramble)、转染PKCδ敲低的慢病毒组(PKCδknockdown)、转染PKCε敲低的慢病毒组(PKCεknockdown)。4.Western blot检测各组中PKCδ、PKCε、P-AKT、AKT、P-ERK、ERK的表达情况。5.Brdu检测各组细胞增殖情况。6.对各组实验结果进行数据整理和统计学分析。结果:1.低氧上调PKCδ、PKCε导致肺动脉平滑肌细胞增殖。由Brdu检测结果可知,与各自低氧组相比,常氧+PKCδ激动剂组和常氧+PKCε激动剂组的细胞增殖无明显差异(P>0.05);与各自常氧组相比,低氧+PKCδ抑制剂组和低氧+PKCε抑制剂组的细胞增殖情况无统计学差异(P>0.05)。与各自常氧组相比,常氧+PKCδ激动剂组和常氧+PKCε激动剂组的细胞增殖明显提高(P<0.05),说明单纯上调PKCδ和PKCε可以诱导肺动脉平滑肌细胞的增殖。与各自低氧组相比,低氧+PKCδ抑制剂组和低氧+PKCε抑制剂组的细胞增殖情况明显降低,说明在低氧条件下抑制蛋白激酶C使得肺动脉平滑肌细胞的增殖被抑制。2.低氧通过上调PKCδ和PKCε而诱导AKT、ERK的磷酸化。由Western blot结果可知,与各自常氧组相比,常氧+PKCδ激动剂组和常氧+PKCε激动剂组的PKCδ和PKCε的表达明显升高(P<0.05);与各自低氧组相比,低氧+PKCδ抑制剂组和低氧+PKCε抑制剂组的PKCδ和PKCε的表达明显降低(P<0.05),说明PKCδ和PKCε的激动剂和抑制剂的激动效果和抑制效果符合实验要求。与各自常氧组相比,常氧+PKCδ激动剂组和常氧+PKCε激动剂组的AKT和ERK的磷酸化显著增加(P<0.05);与各自低氧组相比,低氧+PKCδ抑制剂组和低氧+PKCε抑制剂组的AKT和ERK的磷酸化被显著抑制(P<0.05)而常氧+PKCδ激动剂组和常氧+PKCε激动剂组的AKT和ERK的磷酸化无明显变化(P>0.05)。说明低氧可以通过诱导PKCδ和PKCε的上调而增加AKT和ERK的磷酸化。3.低氧通过上调PKCδ和PKCε诱导AKT、ERK的磷酸化增加而诱导肺动脉平滑肌细胞增殖。慢病毒转染后,低氧培养72h,由Western blot结果可知,PKCδ和PKCε的敲除成功,与正常低氧组相比,PKCδ和PKCε的敲除组AKT和ERK的磷酸化明显被抑制(P<0.05),且由Brdu检测结果可知,与正常低氧组相比,PKCδ和PKCε的敲除组的细胞增殖被明显抑制。说明蛋白激酶C被敲除而导致AKT和ERK的磷酸化下降,从而导致肺动脉平滑肌细胞的增殖被抑制。结论:在肺动平滑肌细胞中,低氧可以通过诱导PKCδ和PKCε的上调,进而诱导AKT和ERK的磷酸化增加,从而促进细胞增殖。